多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对缺氧诱导人视网膜微血管内皮细胞功能的影响

目的观察多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)功能的影响。方法采用三质粒系统构建慢病毒颗粒(LV)-PSF。LV-PSF体外感染hRMECs后通过流式细胞计数法测定其感染效率。应用实时定量PCR(RT-PCR)检测经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA表达水平。将实验分为体内和体外两部分。体内实验:7日龄健康C57B/L6小鼠20只,采用随机数字表法分为正常组、氧诱导视网膜病变(OIR)组、OIR+LV-空载体(Vec)组和OIR+LV-PSF组,每组5只。除正常组外,其余3组构建OIR模型。OIR组除缺氧刺激外,不做其余处理。OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠分别玻璃体腔注射LV-Vec或LV-PSF。观察LV-PSF对视网膜新生血管(RNV)形成的影响。体外实验:将hRMECs分为正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组。正常组为正常体外培养的hRMECs;缺氧组为缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs;空载组、PSF高表达组分别为用LV-Vec、LV-PSF感染48 h,再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs。采用MTT比色法观察PSF对细胞增生能力的影响。采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验观察PSF对缺氧刺激下细胞迁移能力的影响。采用RT-PCR观察各组细胞中HIF-1α、VEGF及PSF的mRNA表达。结果成功构建可稳定高表达PSF的LV-PSF,流式细胞仪测定其感染效率为97%,RT-PCR测得经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA水平明显上调。体内实验:OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV面积较正常组明显增加(t=18.31、43.71),OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积较OIR组(t=11.30)、OIR+LV-Vec组(t=15.47)明显减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。体外实验:MTT比色法检测结果显示,缺氧组hRMECs增生能力较正常组明显增强(t=2.57),PSF高表达组hRMECs增生能力较正常组、缺氧组、空载组明显降低(t=5.26、5.46、3.73),差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,缺氧刺激3 h恢复正常条件24 h或48 h均可刺激缺氧组与空载组细胞明显迁移(t=8.35、13.84,P<0.05);而与缺氧组与空载组比较,PSF高表达组细胞迁移不明显(t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01,P<0.05)。Transwell小室实验结果显示,正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多,而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少(t=9.33、6.15,P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,与正常组比较,缺氧组、空载组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显增加(t=15.23、21.09,P<0.05),PSF mRNA表达无明显变化(t=0.12、2.15,P<0.05);与缺氧组、空载组比较,PSF高表达组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显下降(t=10.18、13.10,P<0.05),PSF mRNA表达明显增加(t=65.00、85.79,P<0.05)。结论PSF可减少OIR模型小鼠RNV面积。PSF可能通过HIF-1α/VEGF信号通路抑制缺氧诱导的hRMECs增生和迁移。     

Krüppel样因子6对于TGF-β1诱导的晶状体上皮细胞纤维化的调控作用研究

目的探讨Krüppel样因子6(KLF6)高表达对于转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人晶状体上皮细胞(HLECs)纤维化的促进作用。方法利用脂质体转染的方法将已成功构建的真核表达质粒pEGFP-C2-KLF6及pSilencer-KLF6转染到HLECs中,经实时定量PCR反应(q-PCR)与反转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞中KLF6蛋白的表达水平,以及上皮钙黏素(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)表达水平。经Transwell细胞迁移实验观察细胞迁移情况。结果 pEGFP-C2-KLF6转染72 h后可有效上调HLECs中KLF6的表达水平,pSilencer-KLF6转染72 h后可有效下调HLECs中KLF6的表达水平(P0.05),从而为后续实验奠定基础;与对照组相比较,KLF6高表达组细胞中E-cadherin表达水平显著下降,Vimentin表达水平显著增高,细胞迁移能力升高(P0.05);在0.5 ng/ml TGF-β1刺激72h后,随KLF6表达量的增加,E-cadherin表达水平进一步降低,而Vimentin表达水平进一步增高,细胞迁移能力进一步升高(P0.05)。结论高表达的KLF6通过调控E-cadherin和Vimentin的表达水平,促进了TGF-β1所诱导的人晶状体上皮细胞纤维化过程,KLF6基因表达与体外基础条件下的上皮-间充质转化(EMT)相关。通过生物学手段特异性下调KLF6的表达可在一定程度上发挥对晶状体上皮细胞的保护作用。     

聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子高表达对糖基化终末产物诱导下视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的观察聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)高表达对糖基化终末产物(AGEs)诱导下RPE细胞损伤的保护作用。方法将体外培养的人RPE细胞分为正常对照组(N组)、空白对照组(N+AGAGEs组)、空载体对照组(Vec+AGEs组)、PSF高表达组(PSF+AGEs组)。N组RPE细胞常规培养;N+AGEs组只做转染处理但不导入任何外源性基因的RPE细胞联合AGEs诱导;Vec+AGEs组、PSF+AGEs组利用转染试剂脂质体2000将pcDNA空载体或pcDNA-PSF真核表达质粒导入RPE细胞联合AGEs诱导。除N组以外,其余3组细胞进行相应的转染处理,24 h后应用150μg/ml的AGEs刺激72 h。采用HE染色和Hoechst 33258染色观察PSF高表达对RPE细胞凋亡相关形态改变的影响;通过ROS水平检测分析PSF高表达对AGEs诱导的RPE细胞ROS表达的影响;采用MTT比色法检测PSF高表达对RPE细胞生存力的影响;采用Western blot检测PSF不同作用时间及不同剂量对血红素氧合酶1(HO-1)表达的影响。结果HE染色和Hoechst 33258染色观察发现,N组细胞形态饱满,细胞核呈圆形,细胞质丰富,染色均一;N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞体积缩小,嗜酸性染色增强,细胞核致密浓染、固缩甚至碎裂;PSF+AGEs组细胞形态尚饱满,细胞浆染色较均匀,细胞核染色均一。MTT比色法检测结果显示,PSF高表达可有效提高RPE细胞生存力,但该作用可被ZnPP有效拮抗,且差异有统计学意义(F=33.26,P<0.05)。DCFH-DA法检测结果显示,与N+AGEs组、Vec+AGEs组比较,PSF+AGEs组细胞中ROS产量下降,差异有统计学意义(F=11.94,P<0.05)。Western blot检测结果显示,PSF蛋白以时间、剂量依赖性的方式上调HO-1的表达水平。PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相对表达水平较0 h明显升高,差异有统计学意义(F=164.91,P<0.05)。0.1、0.5、1.0、1.5、2.0μg PSF蛋白作用下的HO-1相对表达水平较0.0μg明显升高,差异有统计学意义(F=104.82,P<0.05)。结论PSF可能通过上调HO-1的表达而抑制ROS产生,从而对AGEs诱导下的RPE细胞损伤发挥保护作用。     

高通量筛选JAK-STAT6信号传导通路抑制剂方法的初步建立

目的构建可用于高通量筛选JAK/STAT6信号传导通路抑制剂的工程细胞株,建立稳定可靠的筛选方法。方法利用基因重组和转染技术,将STAT6特异性识别启动子IgE基因序列和虫荧光素酶报告基因联合插入pCMV质粒,脂质体法转染至HeLa细胞,经潮红霉素B抗性筛选及报告基因检测,得到稳定表达虫荧光素酶的工程细胞株。通过优化溶剂DMSO浓度,IL4作用浓度及孵育时间等筛选条件,建立了可靠的筛选方法,并在此基础上对1600种化合物进行了筛选。结果建立的筛选方法稳定可靠,系统Z′因子达到0.64。通过对1600种化合物的筛选,得到3个抑制效果较理想的化合物并测得其IC50值。结论所建立的高通量筛选方法可用于JAK/STAT6信号传导通路抑制剂的筛选。     

重组pEGFP-C2-p100质粒构建及表达

目的:将人类p100基因定向连入pEGFP-C2质粒,使p100蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,为进一步研究p100蛋白的功能及定位奠定实验基础.方法:采用EcoR I和BamH I双酶切方法,从pSG5-p100质粒中获得p100蛋白的cDNA全长;将该cDNA连接入pEGFP-C2质粒.将构建成功的pEGFP-C2-p100质粒转染入HeLa细胞.荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果:(1)将该质粒进行双酶切鉴定可见p100片段.(2)转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.结论:(1)p1OO cDNA全长成功载入pEGFP-C2质粒.(2)p100蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达.     

微小核糖核酸-204和211在人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化过程的变化

目的 观察人胚胎干细胞（hESC）向视网膜色素上皮（RPE）细胞诱导分化过程中微小核糖核酸（miRNA）-204和211的变化特征。方法 采用自然分化法诱导hESC向RPE细胞分化,细胞鉴定。按细胞诱导分化时间秩序,分为hESC组、含色素细胞组、hESC源性RPE细胞组和原代培养的人胎RPE（hfRPE）细胞组。行miRNA基因表达谱芯片分析、miRNA-204和211实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测。 结果 miRNA芯片分析结果显示,随细胞诱导分化过程, miRNA-204持续上调。其中,含色素细胞组是hESC组的5.026倍,hESC 源性RPE细胞组是含色素细胞组的3.337倍;hfRPE细胞组是hESC源性RPE细胞的13.574倍。miRNA-211在细胞诱导分化过程中上调不明显,但从hESC源性RPE细胞到hfRPE细胞,上调倍数为44.333倍,是miRNA表达谱中差异最大的miRNA。RT-PCR检测结果显示,hESC组、含色素细胞组、hESC源性RPE细胞组、hfRPE细胞组miR-204相对表达量分别为91.81±4.43、2 263.09±206.39、5 996.80±235.42、171 676.45±999.82,差异有统计学意义（t=18.22、20.66、279.38,P＜0.001）;miRNA-211相对表达量分别为2.23±0.31、129.33±3.75、125.76±4.78、16 682.00±352.97。含色素细胞组和hESC细胞组、hfRPE细胞组和hESC源性RPE细胞组miR-211相对表达量比较,差异均有统计学意义（t=58.58、81.24,P＜0.001）。结论 miRNA-204和211在hESC向RPE细胞诱导分化过程中持续单一变化。     

骨形成蛋白4促进视网膜血管内皮细胞增生和迁移

目的:观察氧化应激条件下骨形成蛋白4（BMP4）对人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）的增生和迁移影响。方法:将体外培养的hRMEC分为对照组、4-羟基壬烯醛（HNE）处理组（4-HNE组）、4-HNE+BMP4处理组（BMP4组）。4-HNE组细胞培养基加入10 μmmol/L 4-HNE;BMP4组细胞培养基加入1...     

大鼠非动脉炎性前部缺血性视神经病变模型视神经蛋白质组学分析

目的:定量分析SD大鼠非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)模型中视神经组织蛋白表达变化,并对差异蛋白进行生物信息学分析。方法:选取10只8周龄体质量200~250 g的SPF级雄性SD大鼠,采用孟加拉玫瑰红联合激光光动力方法建立NAION模型,最终选取4只造模成功的大鼠作为NAION模型组,同时取4只体质量和周...     

氧诱导视网膜病变小鼠模型微小RNA表达谱分析

目的 分析氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型的微小RNA表达谱,筛选可能与视网膜新生血管(RNV)形成有关的微小RNA.方法 7日龄健康C57BL/6J小鼠52只随机分为正常对照组和OIR组,每组26只.OIR组建立OIR小鼠模型;正常对照组不做任何处理.小鼠17日龄时,行视网膜铺片,观察视网膜血管形态;行视网膜石蜡切片,计数突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数;行微小RNA芯片分析,检测具有差异表达的微小RNA,再应用实时聚合酶链反应(RT-PCR)进行验证.结果 正常对照组小鼠视网膜血管平滑、均匀有序分布;OIR组小鼠周边视网膜血管纡曲、紊乱并伴有新生血管芽,中央视网膜无灌注区明显.正常对照组、OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积分别为(6.57±3.6)％、(25.81±2.12)％;OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积较正常对照组明显增大,差异有统计学意义(t=28.71,P＜0.001).光学显微镜观察发现,正常对照组小鼠内界膜结构完整、平滑,血管内皮细胞排列整齐,偶见突破内界膜的血管内皮细胞核.正常对照组、OIR组平均每张切片突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数分别为(0.16±0.31)、(28.41±4.01)个.两组平均每张切片突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数比较,差异有统计学意义(t=54.45,P＜0.001).微小RNA芯片分析结果显示,与正常对照组比较,OIR组有21个微小RNA的表达发生了1.5倍以上的变化.其中,上调者9个,下调者12个.差异表达倍数≥3.0的微小RNA为miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c.RT-PCR检测发现,差异表达倍数≥3.0的4个微小RNA,其表达趋势与芯片分析结果一致.与正常对照组比较,OIR组miR-3078的表达明显上调,差异有统计学意义(t=-2.380,P＜0.05);miR-140、miR-29b、miR-29c的表达明显下调,差异也有统计学意义(t=2.638、2.323、2,415,P＜0.05).结论 OIR小鼠模型的微小RNA表达谱中,miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c的差异表达倍数≥3.0,其可能与RNV形成有关.     

PSF不同功能片段融合蛋白的构建及其在细胞内的分布

目的 将人类PSF基因的不同功能片段定向连入pEGFP-C2质粒,使PSF蛋白的各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,观察其在HeLa细胞中的表达及定位. 方法 以重组质粒pEGFP-C2-PSF为模板,PCR法扩增出目的基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP-C2上,构建重组质粒pEGFP-C2- PSF(Ⅰ～Ⅴ).将构建成功的pEGFP-C2-PSF(Ⅰ～Ⅴ)质粒脂质体法转染HeLa细胞,Western印迹检测融合蛋白的表达,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的定位与分布. 结果 成功构建质粒pEGFP-C2-PSF(Ⅰ～Ⅴ),并在HeLa细胞中实现表达;Western印迹检测到融合蛋白GFP-PSF(Ⅰ～Ⅴ);在激光共聚焦显微镜下观察到绿色的融合蛋白表达和定位. 结论 人类PSF基因的不同功能片段的重组质粒pEGFP-C2-PSF(Ⅰ～Ⅴ)构建成功,可用于标记PSF蛋白的不同功能片段,为进一步研究PSF在信号转导中的作用机制以及其生物学功能奠定基础.