糖基化终产物对心肌微血管内皮细胞表达MCP-1和ICAM-1的影响及机制研究

目的：观察体外孵育的牛血清白蛋白（BSA）非酶促糖基化终末产物（AGEs）对心肌微血管内皮细胞细胞间黏附分子（ICAM-1）和单核细胞趋化因子-1（MCP-）表达的影响及机制．方法：取50g／L牛血清白蛋白（BSA）、500g／LD-葡萄糖,于37℃孵箱内避光孵育12wk,制备外源性AGEs-BSA．体外培养大鼠心肌微血管内皮细胞（CMECs）．分设不同浓度梯度的AGEs实验组、BSA对照组,采用ELISA法测定MCP-1的表达,流式细胞术测定ICAM-1的表达,Western Blot法测定糖基化终末产物受体蛋白（RAGE）的表达,RT-PCR检测RAGE mRNA的表达．结果：100,200,400mg／L AGEs可显著增加心肌微血管内皮细胞ICAM-1（13．2％,14．5％,38．1％）,MCP—1[（52．5±5．5）,（116．0±3．1）,（139．6±8．7）μg/L]的表达（与对照组相比较,P〈0．05）,且在蛋白水平及mRNA水平均明显增加RAGE的表达（P〈0．05）,并呈浓度依赖性．结论：AGE—BSA可刺激心肌微血管内皮细胞过量表达ICAM-1和MCP-1,从而加速心肌微血管炎症的发生与发展．其机制可能是AGEs上调了心肌微血管内皮细胞RAGE的表达．也进一步证实了AGEs—RAGE信号系统的起动是糖尿病心肌微血管病变发生发展一个重要原因．     

胰岛素抑制糖基化终产物诱导心肌细胞炎症反应的研究

目的探讨糖基化终产物（AGEs）和胰岛素对乳鼠心肌细胞炎症反应的影响。方法原代培养乳鼠心肌细胞,分别用50mmol／L葡萄糖孵育的糖化白蛋白（AGE-BSA）、胰岛素（10^-8mol／L）、糖化白蛋白加胰岛素干预24h,采用RT-PCR、免疫细胞化学染色、透射电镜法,观察AGE—BSA,胰岛素及AGE-BSA联合胰岛素对细胞PPAR-γmRNA和TNF—αmRNA表达、NF-κB活化以及细胞超微结构的影响。结果AGE—BSA可诱导心肌细胞TNF-αmRNA表达及NF—κB活化,并可抑制PPAR—γmRNA表达,与对照组比较有显著差异（P〈0．05）。胰岛素可抑制AGE—BSA诱导的TNF-αmRNA表达及NF—κB活化,并使PPAR—γmRNA表达上调,与AGE—BSA组比较有显著性差异（P〈0．05）。AGE—BSA干预后的心肌细胞内内质网及线粒体增多,提示细胞发生非特异性炎症反应,而胰岛素可明显减轻AGE—BSA导致的病理改变。结论AGE-BSA可通过诱导心肌细胞表达TNF-αmRNA及NF-κB活化,促使心肌细胞发生炎症反应,进而对心肌细胞造成损伤。胰岛素通过抑制TNF—αmRNA的表达并上调PPAR-γmRNA表达,可减轻AGE—BSA诱导的心肌细胞炎症反应,提示胰岛素在糖尿病心肌病的发病机制中具有重要的保护作用。     

普伐他汀抑制C-反应蛋白诱导的HUVEC细胞合成TNF-α和IL-6

目的：观察C-反应蛋白（CRP）刺激对人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）分泌功能的影响。方法：体外培养HUVECs,检测细胞对CRP诱导的反应以及普伐他汀干预效应。酶联免疫吸附试验检测培养液上清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的水平。电泳漂流技术（EMSA）检测细胞核提取物中NF-κB与DNA的结合活性。结果：TNF-α和IL-6的水平随CRP刺激浓度的升高而增加,呈剂量依赖性（0-100 mg/L）,在5 mg/L CRP时即可检测到TNF-α和IL-6表达,100 mg/L CRP时可见最大效应。50 mg/L CRP呈时间依赖性增加TNF-α和IL-6的表达（0-48 h）,24 h达高峰。普伐他汀有效抑制CRP诱导的NF-κB激活和炎症因子表达。结论：CRP剂量依赖性激活血管内皮细胞的炎症因子表达,其中NF-κB途径被激活,参与致动脉粥样硬化作用;他汀类药物能有效抑制该途径,发挥抗炎及抗动脉粥样硬化作用。     

核因子-κB在重症急性胰腺炎大鼠胰腺组织中的表达

目的探讨核因子-κB在重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）发病中的影响及作用。方法36只SD大鼠随机分成SAP组、假手术组。动态观察各组大鼠血清淀粉酶、胰腺组织中NF-κB的表达及胰腺组织病理变化。结果SAP组大鼠血清淀粉酶、胰腺组织学病评分比假手术组明显升高（P〈0．01）；术后3h起，SAP组胰腺组织中NF-κB p65即持续上调，呈时间依赖性，12h与3h比较差异显著（P〈0．01），假手术组无明显表达（P〈0．01）。结论NF-κB的活化作为始动因子参与急性胰腺炎的炎症反应．NF-κB表达与胰腺组织损伤呈正相关，抑制NF-κB的表达有可能减轻胰腺炎症。     

绞股蓝皂苷对 AGEs 诱导下肾小球系膜细胞中核因子－κB 表达的影响

目的：观察绞股蓝皂苷（GP）对晚期糖基化终末产物（AGEs）诱导下人肾小球系膜细胞（HMCs）中核因子－κB（ NF－κB）表达的影响。方法将对数生长期的HMCs分为空白组、模型组、阳性组以及GP低、中、高剂组。空白组不给予任何诱导和干预,模型组、阳性组以及GP低、中、高剂量组均采用200 mg／L的AGEs诱导HMCs,GP低、中、高剂量组分别给予低、中、高剂量（25、75、150 mg／L）的GP干预,阳性组同时给予10－1 mmol／L的氨基胍盐酸盐（ AG）干预,培养72 h。半定量Real－Time PCR法检测各组中NF－κB mRNA的表达;Western blot－ting法检测各组中NF－κB蛋白的表达。结果模型组中NF－κB表达量较空白组增加（ P＜0．01）;GP干预后, HMCs中NF－κB表达量较模型组减少,且随着浓度增加,表达量逐渐减少（ P＜0．01）。结论 GP防治DN的机制可能与其呈剂量依赖性下调NF－κB的表达相关。     

PDTC对重度颅脑损伤后NF-κB表达的影响

目的：观察核转录因子-κB（NF-κB）在大鼠创伤性脑损伤（TBI）后脑组织损伤区的表达变化，同时探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）对其表达的影响。方法：参照改良Feeney自由落体脑损伤装置制备大鼠重度脑损伤模型，将72只大鼠随机分为TBI组、PDTC干预组和假手术对照组，每组分别于伤后2h、12h、24h、48h断头，取出损伤区脑组织，检测各组的NF-κBmRNA表达水平。结果：TBI组NF-κB于伤后2h表达增强，12h表达明显增加，24h达到高峰，48h略有下降，与假手术对照组相比差异显著（P〈0．05）。PDTC干预组与TBI组相比，NF—κBmRNA表达明显下降，差异显著（P〈0．05）。结论：大鼠重度TBI后，NF—κB的活化及过度表达参与了继发性脑损伤过程，PDTC可以通过抑制NF—κB的表达，对TBI起到保护作用。     

核转录因子-κB及肿瘤坏死因子-α在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的表达及NAC对其表达的影响及对视网膜的保护作用

目的探讨核转录因子-κB（NF—κB）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的表达及N-乙酰-L-半胱氨酸（N—acetylcysteine）对其表达的影响及对视网膜的保护作用。方法建立结扎左侧颈总动脉的大鼠视网膜缺血再灌注模型，60只SD大鼠随机分为缺血再灌注组和缺血再灌注＋NAC组。每组按再灌注后不同时间段分为1、6、12、24、48和72h组，每组5只，以原位杂交法检测视网膜中NF—κB和TNF-α的表达，每只大鼠处死前行视网膜电图（ERG）检测。并计算出左／右眼ERG的比值。结果缺血再灌注组在6h开始检测到NF-κB和TNF—α的表达，在24h表达最强，以后逐渐减弱。缺血再灌注＋NAC组在再灌注6h未能检测到NF-κB和TNF-α的表达，在第12h有NF-κB和TNF-α的表达，24h表达最强，但低于缺血再灌注组（P〈O．05）。缺血再灌注组在再灌注6h后各期ERG相对恢复率明显低于缺血再灌注＋NAC组（P〈0．05）。结论NF-κB及其诱导的TNF-α在视网膜缺血再灌注损伤中发挥重要作用，NAC可能通过抑制NF-κB的活性减轻视网膜缺血再灌注损伤。     

慢性肾衰竭大鼠主动脉NF-κB的表达变化

目的探讨尿毒症时主动脉局部炎症信号NF-κB表达变化。方法采用单肾切除、对侧肾动脉部分结扎法建立慢性肾衰竭模型，RT-PCR检测NF-κB p65亚基、I-κB mRNA表达水平，免疫组织化学检测p65亚基蛋白表达，凝胶迁移率法测定NF-κB活性，并用图像分析定量。结果与正常大鼠比较，慢性肾衰竭大鼠主动脉NF-κB p65亚基mRNA表达水平显著升高（P〈0．01），而I-κB mRNA表达水平显著降低（P〈0．01），NF-κB p65亚基蛋白表达和活性也显著增加（P〈0．01），并随病程延长而进一步上升。蛋白酶体抑制剂MG-132可明显抑制慢性肾衰竭大鼠主动脉NF-κB组分表达和活性升高。结论慢性肾衰竭大鼠主动脉NF-κB炎症信号通路存在显著活化。     

联胺对人脐静脉内皮细胞中IL-8表达及NF-κB蛋白活化的影响

目的探讨联胺对培养的人脐静脉内皮细胞表达IL-8及核因子-κB活化的影响。方法酶联免疫吸附法检测IL-8蛋白的表达,逆转录聚合酶链反应法检测IL-8mRNA的表达,细胞免疫化学法观察NF-κB的活化。结果联胺（1、5和10μmol/L）可诱导IL-8在蛋白及mRNA水平表达,与对照组差异有显著性意义（P〈0.05）,且与联胺呈浓度依赖性。联胺（5μmol／L）作用人脐静脉内皮细胞30min后发现NF-κB从胞质向胞核转移,60min达高峰,持续到120min。结论联胺能诱导IL-8在蛋白及mRNA水平表达,其机制可能是通过NF-κB活化实现的。     

氯胺酮对内毒素诱导大鼠急性肺损伤的影响及其机制

目的探讨不同剂量氯胺酮对内毒素（LPS）诱导大鼠肺损伤的影响和作用机理。方法48只雄性Wistar大鼠随机分为4组：对照组,LPS组（5mg／kg）,低剂量氯胺酮治疗组（5mg／kg）,高剂量氯胺酮治疗组（10mg／kg）,每组12只。建立内毒素诱导的大鼠急性肺损伤模型,于注射LPS后4h处死大鼠,测肺湿／干重比,观察支气管肺泡灌洗液（BALF）中性粒细胞计数比、蛋白浓度,测肺组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-8（IL-8）、NO水平。RT．PCR测肺组织中．NOSmRNA表达,Western-blot测肺组织中NF-κB蛋白表达。结果LPS组大鼠肺湿／干重比、BALF中性粒细胞计数比、蛋白浓度均明显增加（P〈0．01）,肺组织中TNF-α、IL-8、NO水平显著性升高（P〈0.01）,同时肺组织中iNOSmRNA和核因子-κB（NF-κB）蛋白表达均增加。而氯胺酮治疗组的各项指标均较LPS组减轻,大剂量组作用更明显。结论氯胺酮通过抑制NF-κB表达,减少炎症性细胞因子的产生,从而对内毒素（LPS）诱导的大鼠肺损伤有一定保护作用。     

Effects of advanced glycation end products on renal fibrosis and oxidative stress in cultured NRK-49F cells

Background Advanced glycation end products （AGEs） play a critical role in the development of diabetic nephropathy. Reactive oxygen species （ROS） may play a critical role in AGEs induced growth factor expression. In this study, the effects of AGEs on transforming growth factor β1 （TGF-β1）, connective tissue growth factor （CTGF） and fibronectin （Fn） mRNA expression and oxidative stress in cultured NRK-49F cells were examined. Methods NRK-49F cells were incubated with medium containing different doses of AGEs （50, 100 or 200 μg/ml） for 24 hours, or with AGEs 100 μg/ml for different times （0, 12, 24 or 48 hours）. Cells in the serum-free medium or medium containing 25 mmol/L glucose were controls. Cells were treated with 25 mmol/L glucose and 100 μg/ml AGEs for 24 hours to determine the effects between AGEs and glucose. We clarified the role of antioxidant by pretreating cells with N-acetylcysteine （10 mmol/L）, ginkgo biloba extract （50 or 100 mg/L） for 24 hours and with 100 μg/ml AGEs for further 24 hours. Alamarblue dye assay was used to analyze cell growth; intracellular ROS generation was measured by flow cytometry; intracellular glutathione by fluorescence spectrophotometry; expressions of TGF-β1, CTGF and Fn mRNA by semiquantitative RT-PCR. Results AGEs significantly increased the expressions of TGF-β1, CTGF, Fn mRNA and intracellular ROS generation, and decreased the glutathion level in NRK-49F cells in dose- and time-dependent manners. High glucose and AGEs together significantly increased the expression of TGF-β1, CTGF and Fn mRNA, compared with AGEs and high glucose separately. Preincubation with N-acetylcysteine or ginkgo biloba extract increased GSH level, suppressed AGEs-induced oxidative stress and TGF-β1, CTGF and Fn mRNA overexpression. Conclusions AGEs can significantly increase expression of TGF-β1, CTGF, Fn mRNA in NRK-49F cells through enhancement of oxidative stress. The accumulation of AGEs may play a pivotal role in the pathogenesis of tubulointerstitial fibrosis in diabetic nephropathy. Suppression of AGEs induced TGF-β1, CTGF and Fn mRNA overexpression in renal fibroblasts through inhibition of oxidative stress may be a mechanism underlying effect of ginkgo biloba extract in diabetic nephropathy. In addition, antioxidant therapy may help prevent AGEs accumulation and its induced damage.     

N-乙酰半胱氨酸对脂多糖刺激人子宫平滑肌细胞白细胞介素8表达的影响

目的探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对脂多糖(LPS)刺激离体培养的人晚期妊娠子宫平滑肌细胞IL-8表达和核转录因子(NF-κB)活性的影响。方法原代培养足月未临产的子宫平滑肌细胞,10μg/mL LPS与经浓度分别为0(生理盐水对照,NS)、5、10、15 mmol/L的NAC预处理的子宫平滑肌细胞作用8 h,以及10 mmol/L的NAC或NS预处理的子宫平滑肌细胞经LPS干预0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h,收集细胞免疫印迹检测NF-κB P65合成情况、RT-PCR检测IL-8 mRNA表达及上清液ELISA检测IL-8浓度。结果1NAC在5~15 mmol/L呈剂量依赖性抑制LPS刺激IL-8蛋白合成和mRNA表达。2随着NAC浓度由低至高,NF-κB P65合成由强到弱,差异有统计学意义(P<0.01),其变化趋势与IL-8 mRNA一致。结论NAC能抑制LPS刺激晚期妊娠子宫平滑肌细胞IL-8蛋白合成和基因表达,可能与其抑制NF-κB激活有关。     

AGEs对人腹膜间皮细胞FN和CTGF的合成和表达作用研究

目的 观察糖基化终末产物（AGEs）对体外培养的人腹膜间皮细胞（HPMC）纤维连接蛋白（FN）和结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响.方法 分别以不同浓度的AGEs（0、200、600、1 000mg/L）刺激HPMC 48h后,用RT-PCR法检测FN的表达情况.同时将体外培养的HPMC分为正常组（未加任何刺激因素）和AGEs组（终浓度为600mg/L）,两组均予刺激HPMC48h后,用RT-PCR及ELISA法检测细胞内FN和CTGF mRNA及蛋白的表达水平.结果 AGEs呈剂量依赖性上调HPMC FN mRNA的水平;AGEs组FN、CTGF mRNA和蛋白表达水平均较正常组明显增加（P＜0.05或0.01）.结论 AGEs可诱导体外培养HPMC的FN、CTGF基因和蛋白高表达.     

糖基化终末产物对大鼠肾系膜细胞基质金属蛋白酶2活性和表达的影响

目的：观察糖基化终末产物（AGEs）对大鼠肾小球系膜细胞基质金属蛋白酶2（MMP-2）活性和表达的影响。 方法：体外培养正常大鼠肾小球系膜细胞,糖化牛血清白蛋白作为刺激物,未经糖化的牛血清白蛋白及常规培养作为对照,分别用含100 mg•L^-1 AGEs（AGEs组）、100 mg•L^-1牛血清白蛋白（BSA组）和不含刺激物（DMEM组）的无血清DMEM培养基,作用于系膜细胞48 h后,酶谱法检测各组系膜细胞上清MMP-2活性,逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测系膜细胞MMP-2 mRNA的表达。 结果：与BSA组及DMEM组比较,AGEs组系膜细胞MMP-2 mRNA的表达明显下降(P<0.01),上清MMP-2活性明显降低(P<0.01)。 结论：AGEs能降低大鼠肾小球系膜细胞MMP-2的活性和表达。     

滋阴活血解毒方对AGEs诱导VEC损伤黏附分子及凝血相关因子表达的影响

目的 观察滋阴活血解毒方对糖基化终末产物(advanced glycation end-producs,AGEs)诱导血管内皮细胞(vas-cular endothelial cell,VEC)损伤的影响及其黏附分子、凝血相关因子表达的变化,进一步探讨该方对AGEs诱导VEC损伤的保护作用.方法 以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)作为实验对象,以终浓度(100 mg/L)的AGEs诱导HUVEC损伤.各模型组及给药组细胞分别继续培养12、24、48 h.在显微镜下观察各组细胞形态变化,并以Western-blot法检测各组黏附分子VCAM-1、ICAM-1的表达;以RT-PCR方法 检测TF、TM mRNA表达.结果 相对于空白组细胞,模型组细胞出现异常增殖,细胞数量明显增多,多数细胞变形皱缩,胞膜轮廓模糊,细胞内出现粗糙样颗粒变化,VCAM-1、ICAM-1、TF表达明显上调,TM表达下调,且在作用24 h后差异有显著性意义(P<0.01);相同时间点,给药组较模型组圆缩形细胞减少,能下调VCAM-1、ICAM-1、TF表达,上调TM表达,且随着作用时间的延长更明显(P<0.01).结论 滋阴活血解毒方能抑制AGEs对VEC的损伤,降低黏附分子的表达,下调表达组织因子mRNA转录,上调血栓调节素mRNA转录.     

去甲斑蝥素对高糖刺激的HK-2 细胞FN,Col IV 和TGF-β1 mRNA 及蛋白表达的影响

目的:观察去甲斑蝥素(NCTD) 对高糖刺激的HK-2 细胞外基质和TGF-β1 表达的影响。方法:常规培养HK-2 细胞,无血清DMEM 培养基同步培养24 h,细胞分为正常葡萄糖组(C,D-glucose 5.5 mmol/L)、甘露醇对照组(M,5.5 mmol/L D-glucose+24.5 mmol/L mannitol)、高糖组(HG,30 mmol/L D-glucose)、高糖+NCTD 干预组(30 mmol/L D-glucose+0.5~40 mg/L NCTD)。台盼蓝排斥实验检测NCTD 对高糖刺激的细胞毒性。MTT 法检测NCTD 对高糖刺激的细胞增殖的影响。收集培养6,24,48 h 后细胞总RNA 及蛋白,用RT-PCR 检测细胞FN,Col Ⅳ和TGF-β1 mRNA 的表达,采用Western 印迹检测FN,Col Ⅳ和TGF-β1 蛋白的表达。结果:不同浓度NCTD 作用72 h 后,浓度超过5 mg/L 的NCTD 对高糖环境下的HK-2 细胞有明显的毒性。RT-PCR 和Western 印迹结果显示: 30 mmol/L D- 葡萄糖可引起HK-2 细胞FN,Col Ⅳ和TGF-β1 mRNA 及蛋白水平的升高(P<0.05),而5 mg/L NCTD 可抑制高糖刺激的FN,Col Ⅳ和TGF-β1 的表达(P<0.05)。相同渗透浓度的D- 甘露醇组对上述指标均无影响(P>0.05)。结论:NCTD 能下调HK-2 细胞FN,Col Ⅳ及TGF-β1 的表达。     

球状脂联素对晚期糖基化终产物诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的蛋白表达影响

目的:研究球状脂联素(gAd)抑制晚期糖基化终产物(AGEs)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的相关蛋白表达。方法:体外用AGEs培养HUVECs,经四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定细胞活性,Annexin V-FITC/PI双染标记法检测细胞凋亡,免疫印记法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:AGEs作用HUVECs,经MTT和流式细胞仪检测,细胞凋亡具有AGEs浓度依赖性。相同浓度AGEs作用HUVECs时,gAd预处理组与非预处理组比较,明显抑制HUVECs凋亡。免疫印记结果显示gAd预处理组与非预处理组比较,gAd可明显抑制Bax蛋白表达,增强Bcl-2蛋白表达。结论:gAd可通过激活Bcl-2、抑制Bax蛋白表达,拮抗AGEs诱导HUVECs凋亡。     

胰岛素对糖尿病大鼠潜在皮肤病变防护作用的机理研究

目的探讨胰岛素对糖尿病潜在皮肤病变保护作用的机理。方法用链脲佐菌素(STZ)将8周龄雄性SD大鼠诱导成速发型糖尿病大鼠模型,分为应用胰岛素强化控制血糖组(A组)(n=27)和未控制血糖组(B组)(n=27),并以正常大鼠作对照(C组)(n=27),分别于致病后4、8和12周获取大鼠背部中央的皮肤标本。应用HE染色,观察皮肤组织学的改变;应用Beckman′s生化自动分析仪检测皮肤组织匀浆的糖含量;采用F3010荧光分光光度计和免疫组织化学技术测定皮肤中晚期糖基化终末产物(AGE)含量的变化;应用透射电镜观察皮肤微血管超微结构的改变。结果组织学观察,致病后12周B组糖尿病大鼠皮肤明显变薄,表皮细胞层次欠清晰,部分表皮缺乏复层排列;真皮层部分胶原萎缩、肿胀,退化变性,并伴随程度不等的炎性细胞浸润;皮下脂肪进行性萎缩或消失。A组糖尿病大鼠皮肤未出现上述明显的组织学改变。B组糖尿病大鼠皮肤糖含量在各时相点均明显高于A组和C组(P<0.01),而A组与C组之间差异无统计学意义(P>0.05)。B组和A组糖尿病大鼠皮肤胶原提取液的荧光值均高于相应年龄正常大鼠,病程越长,荧光值增加越明显。8周和12周的B组糖尿病大鼠皮肤胶原提取液的荧光值明显高于同期A组的糖尿病大鼠;8周时B组为(34U/mg±4U/mg),A组为(29U/mg±3U/mg,P<0.05);12周时B组为(41U/mg±4U/mg),A组为(32U/mg±4U/mg,P<0.05)。免疫组织化学检查亦显示B组糖尿病大鼠皮肤中AGE表达阳性率于8周和12周均显著高于A组,8周时B组为32%±4%,A组为25%±5%,(P<0.05);12周时B组为39%±5%,A组为27%±4%,(P<0.05)。透射电镜观察A组糖尿病大鼠皮肤血管内皮细胞变性和基底膜增厚程度均明显好于B组。结论皮肤中AGE蓄积和高糖是糖尿病皮肤病变的重要致病因素之一,胰岛素对糖尿病大鼠潜在皮肤病变具有防护作用,其作用机制可能与严格控制血糖、抑制AGE的合成、阻断AGE的作用环节等有关。