肝郁证模型大鼠血清蛋白质组的差异表达研究

目的:通过分析肝郁证模型大鼠血清蛋白质组的差异表达,从蛋白质组学角度探讨肝郁证的实质。方法:以束缚制动法制备肝郁证大鼠模型,二维凝胶电泳(2-DE)分离大鼠血清蛋白质,获得差异表达蛋白质;利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和数据库分析鉴定差异表达蛋白质。结果:发现9个具有明显表达差异的蛋白质斑点,经鉴定可以确定的6个蛋白质分别为:转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)、水解酶Ba1-647、血清白蛋白前体、抗乙酰胆碱受体抗体Fab片段、Ig-λ2链C区和β1球蛋白。结论:筛选出的差异表达蛋白质主要涉及免疫、神经内分泌和营养物质代谢方面,和现有研究结果相符,证实从蛋白质组学的角度研究证实质是可行的。     

温热中药对寒症模型大鼠肝线粒体蛋白质组的影响

目的 应用双向电泳和质谱技术研究温热中药对寒证模型大鼠肝线粒体蛋白质组的影响,阐述寒证与能量代谢的关系及温热中药的作用。方法 提取正常大鼠、寒证模型大鼠和温热中药治疗后大鼠的肝线粒体蛋白质,经双向电泳分离后获得蛋白质组图谱,用Image Master 2D 6.0软件进行差异蛋白质分析,筛选出差异蛋白,进行质谱鉴定,用Western blotting法验证差异蛋白的表达。结果 寒证大鼠肝线粒体中H⁺转运ATP合酶、电压依从性阴离子选择性通道蛋白1（VDAC）表达量增加,伴侣素groEL、丝氨酸蛋白酶抑制剂、Tu转运延伸因子、乙醛脱氢酶、二甲基甘氨酸脱氢酶、脂酰辅酶A脱氢酶、热休克蛋白60、酰基辅酶A脱氢酶、丝氨酸蛋白酶、电子传递黄素蛋白、腺苷酸激酶、DJ-1蛋白、羧酸酯水解酶、氨甲酰磷酸合成酶1表达量降低;应用温热中药治疗后F1-ATP合酶、H⁺转运ATP合酶表达量降低,丙酰辅酶A羧化酶、二氢硫辛酰胺支链酰基转移酶、Tu转运延伸因子、乙酰辅酶A酰基转移酶、脂酰辅酶A脱氢酶、丝氨酸蛋白酶、丙酮酸脱氢酶、3-巯基丙酮酸硫基转移酶、40 S核糖体蛋白、热休克蛋白1、烯酰辅酶A水解酶表达量增加。结论 寒证模型大鼠线粒体内脂肪酸的β-氧化受阻,蛋白质的合成、折叠及分泌障碍,类固醇激素减少影响糖代谢,导致能量不足。应用温热中药治疗后,糖、脂代谢增强、蛋白质合成增加导致能量代谢活跃。     

温补肾阳药对丙基硫氧嘧啶引起肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组的影响

目的：应用凝胶内差异显示电泳技术研究温补肾阳药对药物性肾阳虚动物肝线粒体蛋白质组的影响。方法：正常大鼠、通过喂饲丙基硫氧嘧啶造成肾阳虚模型大鼠和温补肾阳药治疗大鼠的肝线粒体蛋白质经荧光染料Cy2、Cy3、Cy5标记，等量混合后在同一胶中进行电泳分离，经不同光激发后扫描得到不同样品的蛋白质组图谱。经DeCyder软件进行差异蛋白质组分析，筛选出16个差异蛋白质。经质谱测定及数据库比对，其中10个蛋白质得到鉴定。结果：肾阳虚时氨甲酰磷酸合成酶1、二氢硫辛酰胺支链酰基转移酶、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白I、异戊酰辅酶A脱氢酶、热休克蛋白60、琥珀酰CoA合成酶、羟氨基辅酶A脱氢酶／酮脂酰辅酶乙酰辅酶A脱氢酶α亚基、鸟氨酸转氨甲酰酶、谷胱甘肽过氧化物酶表达量均增加，而鸟氨酸氨基转移酶表达量降低。应用温补肾阳药治疗后，上述蛋白质的表达量均有不同程度的纠正。结论：喂饲温补肾阳药的肾阳虚模型大鼠糖、脂类和蛋白质代谢均得以改善，可能与温补肾阳药维护线粒体膜稳定性有关。     

六味地黄汤对甲亢型肾阴虚大鼠肝线粒体蛋白质组的影响

目的 应用双向电泳技术和质谱技术研究六味地黄汤对甲亢型肾阴虚大鼠肝线粒体蛋向质组的影响.方法 双向电泳分离甲状腺素造成的肾阴虚模型和六味地黄汤治疗大鼠肝线粒体蛋白质,银染后扫描得到蛋白质组图谱,用Image Master2D6.0软件进行差异蛋白质组分析,筛选差异在2倍以上的蛋白质进行质谱鉴定和生物信息学分析.结果 大鼠Major urinary protein precursor、Peroxiredoxin-6、内质网蛋白29前体、大鼠转甲状腺素蛋白D链表达升高,78 kDa葡萄糖调节蛋白前体、谷胱甘肽硫转移酶Mu 1、热休克蛋白60、肽基脯氨酰顺反式异构酶、核转录因子-κB 2、H~+-转运ATP合酶、BNIP1 protein表达均降低.结论 六味地黄汤滋阴补肾作用机理可能与下调线粒体内H~+-转运ATP合酶表达量从而减缓能量代谢、抑制NF-κB过量表达和活化以调节炎性细胞因子紊乱状态和凋亡抑制状态、上调PDX6表达对抗氧自由基损伤以及增强性激素分泌水平相关.     

基于双向凝胶电泳技术的中医寒、热体大鼠蛋白质组表达谱研究

目的：利用双向凝胶电泳技术对中医寒、热体大鼠进行蛋白质组表达谱研究,以期寻找与寒热体相关的蛋白质,并探讨中医寒、热体形成的生物学基础。方法：提取大鼠肝脏细胞的总蛋白,采用双向凝胶电泳（2-DE）及MALDI-TOF-MS质谱技术筛选并鉴定寒热体表达差异的蛋白质群。结果：经过筛选和质谱技术共获得10个具有统计学意义的蛋白表达差异点：氨甲酰磷酸合成酶、二硫键异构酶、过氧化氢酶、过氧化氢异构酶、细胞质氨肽酶、谷氨酸脱氢酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶、热休克蛋白前体、同型半胱氨酸、葡萄糖调节蛋白前体。结论：中医寒热体大鼠在蛋白质组表达方面存在一定的差异性,酶类蛋白代谢异常可能是寒热体形成的物质基础之一。     

早期糖尿病肾病不同证候的尿蛋白组学研究

目的:初步探讨尿液中蛋白的差异与早期糖尿病肾病不同中医证型之间的相关性。方法:对符合纳入标准的150例早期糖尿病肾病患者按中医辨证分型分为肝肾阴虚证组、气阴两虚证组和脾肾阳虚证组。用双向凝胶电泳(2-DE)结合质谱分析方法对3组患者尿蛋白进行比较蛋白质组学分析。结果:在肝肾阴虚证高表达的蛋白质有:Nogo蛋白、单克隆抗体Ig M。在气阴两虚证高表达的有:动力蛋白、转铁蛋白、Ig Kappa链、和两种白蛋白。脾肾阳虚证高表达的蛋白质有:白蛋白(分子量52 047.8)、转甲状腺素蛋白、αl-抗胰蛋白酶。结论:这些差异蛋白与早期糖尿病肾病不同证候的形成有关,也为进一步研究证候实质提供依据。     

纤维化大鼠肝组织与物质代谢相关蛋白质动态变化及扶正化瘀方的调节作用

目的 探讨扶正化瘀方干预治疗肝纤维化的作用。方法 将Wistar大鼠随机分正常组、模型组、扶正化瘀方（简称中药）组。大鼠皮下注射40％CCl4-橄榄油溶液造模,正常组仅用生理盐水皮下注射,中药组用中药灌胃,取肝组织做病理、羟脯氨酸、蛋白质的分步提取。蛋白质定量后进行二维电泳,凝胶银染,运用PDQUEST2-DE图像分析软件对获得的蛋白质图谱进行分析,运用MALDI-TOF-MS鉴定了30多个差异表达的蛋白质。结果 （1）模型组大鼠出现生命活动整体反应（如体重、活动度等）下降;（2）肝纤维化过程中存在物质代谢障碍;（3）蛋白质组改变质谱结果显示模型组和正常大鼠肝组织差异表达的蛋白质与物质代谢相关的蛋白质有：过氯酸可溶性蛋白质、磷脂酰肌醇转移蛋白酶、磷酸甘油酸激酶、内质网-60蛋白酶;（4）中药组大鼠肝组织中过氯酸可溶性蛋白质、磷脂酰肌醇转移蛋白酶、磷酸甘油酸激酶、内质网-60蛋白酶的表达趋近正常。结论 在肝纤维化过程中伴有蛋白质合成与分解异常和糖酵解活动增强;中药调节物质代谢相关蛋白质的表达是抗肝纤维化的途径之一。     

甲状腺切除的肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组的研究

目的:应用差异蛋白质组学技术研究肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组.方法:正常大鼠和甲状腺切除的肾阳虚模型大鼠的肝线粒体蛋白质经荧光染料Cy3、Cy5标记,与等量Cv2标记的内标混合后在同一胶中进行电泳分离,经不同光激发后扫描得到不同样品的蛋白质组图谱.经DeCvder6.5软件进行差异蛋白质组分析,并对差异蛋白质进行质谱鉴定.结果:在肾阳虚大鼠肝线粒体中,氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ、乳铁传递蛋白、热休克蛋白60、过氧化氢酶、甲基丙二酸半醛脱氢酶、类钙激活中性蛋白酶、电子传递黄素蛋白、酯酶同工酶ESl、谷胱甘肽过氧化物、ATP合成酶和ATP酶质子通道蛋白表达量均增加,而二氢硫辛酰胺支链酰基转移酶、脂酰辅酶A脱氢酶、鸟氨酸转氨酶和鸟苷酸结合调节蛋白表达量降低.结论:肾阳虚大鼠可能因糖类和脂类物质分解代谢受抑以及细胞内信号转导异常而出现虚寒症状.     

从肝纤维化大鼠肝组织蛋白质组变化探讨肝与他脏关系的蛋白质基础

目的：以CCl4大鼠肝纤维化为模型，研究肝与他脏在生理、病理之间的相互联系，为中医理论对“以象测脏”认识脏象的方法论提供科学依据，探讨中医整体观念的物质基础。方法：将Wistar大鼠，随机分正常组、模型组。模型大鼠皮下注谢40％CCl4-橄榄油溶液每周2次，共2周；停止刺激后再观察4周，正常组以生理盐水替代CCl4皮下注射。分别于第4、8、12、16周末分批处死大鼠。留取肝组织分别做病理、羟脯氨酸、蛋白质的分步提取。蛋白质定量后进行二维电泳，凝胶银染，运用PDQUEST 2-DE图象分析软件对获得的蛋白质图谱进行分析，运用MALDI-TOF-MS鉴定了30多个差异表达的蛋白质。结果：①CCl4肝纤维化大鼠出现生命活动整体反应，如体重、活动度等下降；②肝纤维化过程中存在蛋白质合成和物质代谢碍障；③蛋白质组改变的质谱鉴定。结果显示：肝纤维化大鼠与正常大鼠肝组织差异表达的蛋白质与物质代谢相关的蛋白质有过氯酸可溶性蛋白质、磷脂酰肌醇转移酶、磷酸甘油酸激酶；与神经内分泌相关的蛋白质分子有儿茶酚-邻-甲基转移酶、雌激素转磺酶亚型6、转录起始因子、非粘附性细胞蛋白质。结论：肝与他脏功能相关、病理相连是以蛋白质分子为物质基础，肝纤维化是一个涉及多个功能的整体病变过程。而引起机体整体功能改变的物质基础是蛋白质分子。     

肾阴虚、肾阳虚模型大鼠股骨皮质骨差异蛋白质表达的分析

目的研究肾阴虚、肾阳虚模型大鼠股骨皮质骨差异表达的蛋白质,从功能蛋白质组角度探讨肾阴虚、肾阳虚证的实质。方法将90只大鼠按随机数字表法分为正常组、肾阴虚组和肾阳虚组,每组30只,获取造模成功且表现稳定大鼠的股骨皮质骨,分别进行皮质骨总蛋白的提取制备、双向电泳(2-DE)、凝胶图谱的获取与分析、差异蛋白的质谱分析及相关功能的生物信息学检索。结果 3组大鼠股骨皮质骨总蛋白2-DE凝胶图谱可辨识蛋白点数目均为470个,与正常组比较,肾阴虚、肾阳虚组各有12个差异蛋白,其中有6个是肾阴虚、肾阳虚组共有的差异蛋白,4个表达趋势一致,分别为表达上调的载脂蛋白A-1、α烯醇化酶,表达下调的GDP解离抑制因子β、原肌球蛋白异构体2α-3链;有2个蛋白表达趋势相反,Ⅰ型胶原α-1链在肾阴虚组中表达上调,在肾阳虚组中表达下调;线粒体热休克蛋白60在肾阴虚组中表达下调,在肾阳虚组中表达上调;肾阴虚、肾阳虚组各有6个独自的差异蛋白,其中肾阴虚组有3个蛋白表达上调,3个蛋白表达下调;肾阳虚组6个蛋白表达均下调。结论大鼠股骨皮质骨中,4个共同且表达趋势一致的差异蛋白可以视为肾阴虚、肾阳虚证的共性功能蛋白质组;2个表达趋势相反及12个肾阴虚、肾阳虚组独自的差异蛋白可归为相应证型的差异功能蛋白质组。     

肝阳上亢证患者情绪状态特征临床研究

目的：探讨肝阳上亢证患者的情绪状态特征．以指导临床进行心理干预。方法：选择226例高血压与偏头痛患者。分为肝阳上亢证组、肝郁气滞证组、肝肾阴虚证组．并设健康对照组16例，采用Beck焦虑量表（BAI）及Beck抑郁量表（BDI）对各组进行情绪测越。结果：肝阳上亢证、肝郁气滞证、肝肾阴虚证患者BAI、BDI各项积分均明显高于健康对照组（P〈0．01）。肝阳上亢证BAI积分明显高于肝郁气滞征、肝肾阴虚证（P〈0．01）；肝郁气滞证、肝肾阴虚证BDI积分明显高于肝阳上亢证（P〈0．05或P〈0．01）。结论：肝胆上亢证、肝郁气滞证及肝肾阴虚证患者均有不同程度的焦虑、抑郁情绪状态，肝阳上亢证患者以焦虑情绪状态为土。     

电针肝俞、期门对肝气郁结模型大鼠行为学及HPA轴相关激素的影响

目的:探讨电针对肝气郁结模型大鼠行为学影响及下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴相关激素的调节作用。方法:将Wistar大鼠30只随机分为正常对照组、肝郁模型组、电针治疗组,通过开野实验(Open-Field Test)及蔗糖水消耗实验进行大鼠行为学检测,运用ELISA法检测大鼠血清促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、皮质酮(CORT)含量,3组之间进行比较。结果:与正常组相比,模型组Open-Field Test水平运动得分和垂直运动得分明显减少,蔗糖水偏嗜度明显减少,血清CORT、CRH的含量明显升高,而电针明显增加模型大鼠的水平得分、垂直得分及蔗糖水偏嗜度,并可阻抑血清CRH、CORT的过度分泌。结论:肝气郁结大鼠存在活动度降低、探究行为减少、快感缺失和HPA轴亢进,电针肝俞、期门可抑制CRH、CORT的过度分泌,缓解HPA轴亢进,外在体现为对模型大鼠行为学的改善。     

经前舒颗粒对PMS肝气郁证模型大鼠下丘脑MAOA和MAOB表达水平的影响

目的 通过研究PMS肝气郁证模型大鼠下丘脑MAOA和MAOB基因的表达,探讨PMS肝气郁证的微观发病机制及中药经前舒颗粒的作用靶点.方法 束缚法制备PMS肝气郁证模型大鼠,用经前舒颗粒干预治疗,运用半定量RT-PCR和Western Blotting方法检测正常组、模型组、给药组大鼠下丘脑区MAOA、MAOB mRNA及其蛋白表达水平;通过单因素方差分析及LSD法统计数据.结果 与正常组相比,PMS肝气郁证模型组大鼠MAOA mRNA在下丘脑表达显著升高(P<0.05),蛋白表达极显著升高(P<0.01);MAOB mRNA及蛋白在下丘脑表达均无统计学差异(P>0.05);给药组与模型组相比,MAOA mRNA在下丘脑表达降低(P<0.05),蛋白表达显著降低(P<0.01);MAOB mRNA及蛋白在下丘脑表达均无统计学差异(P>0.05);给药组与正常组相比,MAOA、MAOB mRNA及蛋白在大鼠下丘脑中表达均无统计学差异(P>0.05).结论 模型组大鼠与正常组大鼠相比,下丘脑MAOA基因表达升高,通过经前舒颗粒干预后,恢复正常.说明MAOA基因与PMS肝气郁证相关,并且可能是经前舒颗粒治疗该证的作用机制之一.     

克郁舒神颗粒对实验性恶劣心境肝气郁结证 大鼠海马BDNF的影响

目的:研究克郁舒神颗粒对实验性恶劣心境肝气郁结证大鼠海马脑源性神经营养因子(BDNF)的影响。方法:选择60只雄性Wistar大鼠,随机分为空白组、模型组、克郁舒神颗粒高、中、低(1.50,0.75,0.375 g.kg-1)剂量组和氟西汀组,每组10只。采用慢性不可预见的温和性应激和孤养方法制备实验性恶劣心境肝气郁结证大鼠模型。应用免疫组织化学法检测大鼠海马BDNF蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠大脑海马BDNF阳性神经元细胞明显减少,克郁舒神颗粒中、低剂量可以提高BDNF阳性神经元的面积比,优于高剂量组及氟西汀组(P<0.01);中、低剂量组之间差异无统计学意义。结论:脑组织海马区BDNF含量降低是导致恶劣心境发生的机制之一,克郁舒神颗粒能提高海马BDNF的含量,且疗效优于氟西汀。     

肝气郁证模型大鼠下丘脑单胺类神经递质分析

目的探讨肝气郁证模型大鼠发病的微观机制。方法捆绑法造模制作肝气郁证模型大鼠,采用反相离子高效液相色谱(RP-IP-HPLC)测定大鼠造模后下丘脑中去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴胺(DA)及5-羟色胺(5-HT)4种神经递质含量变化。结果肝气郁证模型大鼠下丘脑中E、DA、5-HT水平显著升高(P<0.05或P<0.01),NE水平显著降低(P<0.01),且用药后均得到明显改善。结论肝气郁证与下丘脑中NE、E、DA、5-HT关系密切。     

经前期综合征肝气逆、郁病证结合模型大鼠外周血和不同脑区性激素及其调节激素含量变化的实验研究

目的:借助前期研制成功的PMS肝气逆、郁两证大鼠模型检测其血清与不同脑区中E2、P、PRL含量,探索"肝失疏泄"的微观机制.方法:挑出动情周期非接受期大鼠40只,随机分为5组:正常对照组、PMS肝气逆证造模组、PMS肝气郁证造模组、PMS肝气逆证造模给药组、PMS肝气郁证造模给药组.肝气逆证大鼠模型以情志刺激为主多因素复合造模法制备,肝气郁证大鼠模型以慢性束缚应激法制备,模型复制成功后肝气逆大鼠模型用经前平颗粒干预,肝气郁证大鼠模型用经前舒颗粒干预.放射免疫法测定血清及中枢中E2、P、PRL含量,比较各组差异并进行分析.结果:旷场实验中,与正常对照组比较,大鼠造模后逆模组水平得分、垂直得分及可旷场实验总分均显著增加(P＜0.05),而郁模组大鼠则显著减少(P＜0.05),用药后这一趋势得到明显纠正(P＜0.05).肝气逆证模型大鼠症状呈现其血清中E2和P含量均呈下降趋势,肝气郁证模型大鼠血清中E2和P含量亦较正常对照组明显降低.中枢内激素变化与血清中相反.结论:PMS两证症状产生可能与体内性激素及其调节激素异常波动有关,经前平、经前舒颗粒可分别对外周血及中枢上述指标的异常变化起到调节作用.     

逍遥散对肝郁证大鼠脑内神经递质的影响

目的:探索逍遥散对肝郁证大鼠中枢神经递质的作用。方法:利用中医证候模型,研究逍遥散对脑内神经递质的作用。结果:肝郁证模型组大鼠脑内NE与DA水平与对照组比较下降明显(P<0.05);肝郁证模型加逍遥散组大鼠脑内NE与DA水平与对照组比较无显著性(P>0.05);结论:肝郁证大鼠脑内NE与DA水平明显降低,逍遥散舒肝解郁,有增加肝郁证大鼠脑内NE、DA神经递质的作用。     

肝乐冲剂治疗慢性病毒性肝炎肝郁脾虚证疗效观察

目的:观察肝乐冲剂治疗慢性病毒性肝炎肝郁脾虚型的疗效。方法:选取慢性病毒性肝炎患者中医辨证为肝郁脾虚型121例,治疗组(61例)给予肝乐冲剂口服治疗,对照组(60例)给予小柴胡片,分别观察症状、体征、肝功能等改善情况。结果:治疗组症状和体征均有改善,肝功能指标治疗前后亦有不同程度改善,尤其是对食欲减退、乏力及ALT、AST的改善作用优于对照组,有效率优于对照组(P<0.05)。结论:肝乐冲剂对慢性病毒性肝炎肝郁脾虚型有明显治疗作用。     

肝郁脾虚证大鼠模型肝脏的差异基因表达

目的:研究肝郁脾虚证大鼠模型肝脏的差异基因表达。方法:大鼠随机分为正常对照组、肝郁脾虚证模型组2组,每组12只。采用慢性束缚+过度疲劳+饮食失节法,连续28d造模,正常对照组不予处理。于制模第29d,处杀2组大鼠,待测肝脏全基因探查。结果:肝郁脾虚证模型大鼠肝脏差异表达的基因59个,其中上调基因27个,下调基因32个。在上调的27个基因中,目前已知的功能基因有Scd1、Dbp、Upp2、Slc28a2、Sds、Hpn、Gldc、Tm7sf2、Gcat。结论:肝郁脾虚证存在异常基因表达,涉及脂类代谢、糖代谢等多个方面。提示多个基因的异常表达可能是中医肝郁脾虚证的分子基础。     

针刺额中线结合肝俞穴治疗肝气郁结型抑郁症的临床观察

目的:观察针刺额中线结合肝俞穴治疗肝气郁结型抑郁症的临床疗效,为临床治疗肝气郁结型抑郁症提供可靠有效的方法.方法:40例符合入选标准的抑郁症患者随机分为治疗组和对照组,治疗组采用针刺额中线结合肝俞穴治疗为主,对照组采用口服抗抑郁药黛力新治疗,治疗前后用HAMD量表评分判断其疗效.结果:治疗后两组HAMD评分有显著性差异(P＜0.05);治疗后治疗组与对照组总有效率分别为90％和85％.结论:针刺额中线结合肝俞穴对肝气郁结型抑郁症有明显的治疗作用,具有一定的临床推广价值.