兔角膜缘上皮细胞体外培养及其生物学特性的初步研究

目的：建立体外培养兔角膜缘上皮细胞的方法,观察其体外生长的生物学特性。方法：应用组织培养的方法,对兔角膜缘上皮细胞进行体外原代和传代培养,用倒置显微镜观察培养的兔角膜缘上皮细胞体外生长的特征,用苏木精-伊红染色、糖原（PAS）染色,细胞角蛋白免疫组化染色和电镜检查的方法对培养细胞进行形态学检查和鉴定。结果：兔角膜缘上皮细胞可以在体外成功的培养传代,原代培养细胞大多48h贴壁,5天后旺盛生长,15天形成单层,传代培养细胞次日贴壁10天形成单层。细胞角蛋白AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性,培养细胞呈多角形,细胞表面具有丰富的微绒毛,细胞之间有桥粒连接,结论：应用组织培养的方法可以成功获得原代和传代培养的兔角膜缘上皮细胞,培养的细胞具有与正常兔角膜上皮细胞相一致的生物学特性。     

兔角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定

目的 建立兔角膜缘干细胞体外培养方法,观察其生物学特性。方法 用含20％胎牛血清1640培养液对兔角膜缘干细胞进行体外培养,倒置显微镜观察培养细胞体外生长的形态,电镜观察培养细胞的超微结构并进行免疫细胞化学和间接免疫荧光鉴定。结果 植块48～72h细胞开始贴壁生长,7～10d形成良好的单层,细胞呈圆形、卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接,胞质丰富,胞质细胞器较多,含有线粒体等结构;免疫细胞化学和间接免疫荧光染色显示,培养第8天少量细胞角蛋白K3(AE5)免疫反应呈阳性,细胞质被染色,培养第14天和第21天,较多细胞．AE5免疫反应阳性。结论 含20％胎牛血清1640培养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。应用组织培养方法获得的原代培养细胞具有与正常角膜缘干细胞相一致的生物学特性。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的实验研究

目的探讨去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的可行性。方法取小块兔角膜缘组织,采用组织块 细胞悬液共培养,待细胞长至对数生长期,分别传代于去上皮羊膜和完整羊膜,甲基偶氮蓝比色(MTT)法对比两组细胞增殖率,并行AE_5免疫鉴定。结果原代细胞接种7d左右,生长至对数生长期,细胞融合成单层。去上皮羊膜组细胞传代培养效果明显优于完整羊膜组。AE_5单克隆抗体染色强阳性。结论去上皮羊膜上培养出的兔角膜缘组织既有角膜上皮特性,又具有强的增殖潜力。     

兔角膜缘干细胞的体外培养和生物学特性观察

目的 探讨兔角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法 采用消化培养法，分2组培养，1组为消化并过滤后的角膜缘干细胞培养组，另1组为消化后未过滤的带组织块培养组，均用含20％胎牛血清的培养液培养，待细胞长成良好单层后消化传代，分别观察记录细胞在原代和传代培养时的生长特性并行HE染色观察。结果 过滤组角膜缘干细胞在培养24h后开始贴壁生长，7～10d形成良好单层，细胞以圆形或椭圆形为主，核较大，呈原始细胞特征，传代培养时见细胞体积逐渐增大，核变小，成纤维细胞少见；带组织块培养组原代培养时与过滤组无明显差异，传代时则见成纤维细胞渐增多，至第3代时占主导并抑制了角膜缘干细胞的生长。结论 采用消化培养法可成功培养出兔角膜缘干细胞，培养时应滤除组织块以减少成纤维细胞的影响。     

兔角膜缘上皮细胞培养联合羊膜行自体移植的实验研究

目的：用体外培养的角膜缘上皮细胞联合人羊膜的方法，行自体移植治疗角膜缘干细胞完全缺乏的兔眼。方法：制作10只兔右眼于细胞缺乏的模型，取其中7只兔的左眼上方角膜缘取一小块组织进行体外培养，并传代在无上皮细胞的人羊膜上。1个月后，手术切除10只兔受伤眼角膜表面被覆的新生血管膜和结膜上皮，7眼接受了含自体培养上皮细胞的羊膜移植，另3眼仅移植无上皮细胞的羊膜。结果：1周后原代培养的角膜缘上皮细胞融合，传代至无上皮细胞的人羊膜上继续生长2～3周，角膜上皮细胞可牢固的附着于羊膜上。移植了含有角膜上皮细胞的羊膜的兔子，术后早期都形成了角膜上皮化，并明显抑制了新生血管的再生，而接受羊膜移植的兔子，术后又出现明显的新生血管。结论：利用无上皮细胞的羊膜作为载体，培养角膜缘上皮细胞并自体移植可以恢复角膜上皮化、抑制新生血管生长。     

人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定方法。方法 应用消化培养法对人胎儿角膜缘上皮组织进行体外培养并观察记录培养细胞的生长特性；对胎儿角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测；并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果 胎儿角膜缘上皮细胞原代培养时生长旺盛，传代培养时保持高增殖速率。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞，并见较多HLA-DR阳性细胞；原代细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性，AEI和PCNA阳性；传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分；扫描电镜观察原代细胞以球形或短圆柱形为主，表面多突起和微绒毛。结论 采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力和低抗原性的人胎儿角膜缘干细胞．为临床眼表重建开辟了新的思路。     

新生兔与成兔角膜缘上皮移植于纤维蛋白胶载体的实验研究

目的：利用组织工程技术体外重建角膜上皮组织，为重建角膜表面提供良好的移植材料和方法．方法：以等量凝血酶和纤维蛋白原作用生成的纤维蛋白胶为载体，分别种植新生兔和成兔角膜缘组织块．体外培养重建角膜上皮层．观察两组细胞的生长覆盖面积，t检验比较两组细胞的生长差异，并从生长特性、形态学特点及免疫细胞化学方面进行观察检测和比较。结果：两组兔角膜缘上皮细胞在纤维蛋白胶上黏附生长增殖，生长覆盖面积差异无统计学意义。体外培养7天左右即能较好地形成单层上皮细胞，2周左右形成的复层上皮细胞与纤维蛋白胶构成角膜上皮组织经检测与生理状态下的角膜上皮组织相近．结论：以纤维蛋白胶为载体、新生兔和成兔体外培养的角膜上皮组织片有些可作为眼表重建角膜上皮移植良好的来源之一。     

深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养方法。方法 将2mm宽的兔角巩膜组织通过程序降温仪降温后置于-196℃液氮中深低温保存。1年后复温，应用消化培养法分别对冻存及新鲜的兔角膜缘干细胞进行体外培养，观察并记录细胞生长情况，HE染色观察培养细胞的形态特征。结果 经过深低温保存的兔角膜缘干细胞可以在体外被成功培养并传代，其在原代培养48h后开始贴壁生长，5d后生长较旺盛，但可见部分破裂和死亡细胞，约12d基本形成单层；传代培养时次日贴壁，7d形成单层。新鲜兔角膜缘干细胞原代培养时细胞形态相似，但破碎死亡细胞少见，且于7d左右即基本形成单层，传代时两者无明显差别。结论 深低温保存的角膜缘干细胞能被成功地进行体外培养，培养后细胞具有与培养的新鲜角膜缘干细胞基本相似的特性，为深低温保存的角膜缘干细胞培养后移植治疗临床眼表疾病提供了实验依据，并为眼库技术的发挥开辟了新的应用途径。     

不同来源人角膜缘干细胞的体外培养研究

目的探讨胎儿和成人角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法应用消化培养法对胎儿和成人角膜缘上皮组织分别进行体外培养,观察记录培养细胞的生长特性并计算其克隆形成率(colony-form-ing efficiency,CFE)。对胎儿和成人角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测;并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果胎儿角膜缘干细胞原代培养时生长旺盛,8~10 d达到生长高峰,CFE为(26.18±4.75)%,传代时保持高增殖速率;成人角膜缘干细胞原代培养时生长不及胎儿细胞旺盛,6~8d达到生长高峰,CFE为(15.45±3.88)%,随着传代次数增加其增殖能力明显下降;两种细胞原代培养时CFE值差异有显著性(t=6.78,P<0.001)。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞,并见较多HLA-DR阳性细胞;胎儿原代培养细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性,AE1和PCNA阳性;传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分;成人角膜缘组织及培养细胞染色结果则见上述干细胞特征细胞数量比例较低,而HLA-DR染色结果相似。扫描电镜观察胎儿原代细胞以球形或短圆柱形为主,表面多突起和微绒毛,成人原代细胞形态相似,但直径较大。结论采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力等干细胞特性的胎儿角膜缘干细胞,其抗原性较培养前明显降低,且其生物学特性显著优于成人角膜缘干细胞,是一种新的优越的角膜缘干细胞来源,将在临床眼表重建中展现广阔的应用前景。     

利用皮肤干细胞的横向分化重建角膜上皮的初步研究

目的 观察皮肤干细胞在角膜基质上的分化发育情况,探讨皮肤干细胞重建角膜上皮的可能性。方法 将体外分离培养的1～4代人和兔皮肤干细胞种植在兔角膜基质上,在体外和体内观察皮肤干细胞的分化发育情况。实验标本作HE染色及用人上皮细胞角蛋白K19单克隆抗体和角膜上皮细胞特异性标志蛋白K3／K12抗体AE5进行免疫组织化学鉴定。结果 皮肤干细胞在角膜基质的调控下可以横向分化发育成表达角膜上皮细胞特异性标志蛋白K3／K12的细胞,呈现AE5抗体阳性;并可形成类似角膜上皮外观透明的多层细胞结构。结论 利用皮肤干细胞有可能重建角膜上皮,进行自体生物角膜的构建。     

Characterization and safety assessment of bioengineered limbal epithelium

Transplantation of cultivated limbal epithelium on substrates such as amniotic membrane is an established treatment for severe ocular surface disease with limbal stem cell deficiency. In this study, we adapted an established method to generate sheets of limbal epithelium on amniotic membrane and characterized the cells contained in these sheets and tested them for safety with regard to microbial contamination. Human limbal biopsies were cultivated on denuded amniotic membranes. After three weeks of culture, the phenotypes of cultivated cells were analyzed by immunohistochemistry and real-time RT-PCR for the expression of a panel of specific markers. Cultivated limbal epithelial cell sheets were also analyzed by scanning (SEM) and transmission (TEM) electron microscopy. Sterility tests and mycoplasma assays were conducted for the safety of product. A confluent layer of polygonal cells was formed in 2 weeks and 1-3 stratified layer of cells were observed after three weeks of culture. Cultivated cells were positive for p63, K3, K19, and involucrin but negative for K14, integrin alpha9 and ABCG2 when analyzed by immunohistochemistry. Expression of molecular markers was detectable with real-time RT-PCR. SEM showed multilayer of flat squamous polygonal epithelial cells. Desmosomal and hemidesmosomal attachments were evident. Our study showed that cultivated limbal epithelium consists of limbal progenitors as well as differentiated corneal epithelial cells. SEM and TEM analysis showed cultivated cells demonstrated typical features of corneal epithelium. The risk of contamination is low and can be prevented by culturing the cells in a clean room facility complying to Good Manufacturing Practice standard.     

Transplantation of corneal stem cells cultured on amniotic membrane for cornea l burn: experimental and clinical study

目的：探讨离体培养的角膜干细胞增殖分化特性,观察干细胞羊膜移植片治疗角膜缘功能障碍的效果。方法：用克隆形成率（colony-forming efficiency,CFE）、免疫组织化学染色等方法观察培养角膜干细胞的增殖力和分化表达状况。角膜干细胞培养后接种生长于羊膜上进行干细胞羊膜片移植,观察角膜上皮、组织浸润和新生血管情况。结果：原代和传第1代角膜干细胞具有高增殖力,部分表达角质蛋白K3,角膜干细胞在羊膜上能够继续增殖分化为多层细胞结构的角膜上皮细胞层;角膜干细胞移植术后可以在角膜比存活,角膜比移植片紧密贴附,角膜上皮完整,经度基质炎性浸润,浅层新生血管减少,深层新生血管充盈减轻,睑球粘连得到松解。结论：角膜缘干细胞羊膜片移植治疗角膜缘功能障碍能够使患获得进一步进行角膜移植的条件。     

角膜缘干细胞移植后供体干细胞的检测与分析

目的观察新西兰兔角膜缘干细胞移植后供体干细胞数量的变化与角膜上皮化的关系,为角膜缘干细胞移植手术效果提供理论依据.方法新西兰兔30只,分为自体移植和异体移植两组,建立角膜缘干细胞缺损动物模型,分别进行自体和异体角膜缘干细胞移植.术后1周、1月、3月空气栓塞各处死5只,取包括角膜缘的角膜标本,免疫组织化学p63蛋白抗体检测供体干细胞的存活数量和增殖分化状况,比较两组的移植效果.结果自体移植术后1周,供体干细胞仍然局限于受体角膜缘;1个月后,上皮细胞覆盖角膜全层,但是层次非常少;3个月后,干细胞的储备数量基本上恢复到正常水平,角膜完全上皮化.异体移植1周,干细胞的数量有一定的减少;1个月后,角膜缘干细胞储备数量明显减少;3个月后,角膜缘已经检测不到干细胞.结论干细胞的储备数量和增殖分化状况直接影响到角膜上皮化的结局;有效的干细胞检测结果可以为临床角膜缘干细胞移植效果提供依据,p63蛋白抗体可以作为一个检测角膜缘干细胞的特异指标.     

Transplantation of human limbal cells cultivated on amniotic membrane for reconstruction of rat corneal epithelium after alkaline burn

Background The transplantation of limbal epithelial cells cultivated on amniotic membrane is a newly developed treatment for limbal stem cell deficiency. The purpose of our study was to investigate the biological characteristics of limbal epithelial cells and evaluate the effect of transplantation of cultivated human limbal epithelial cells on ocular surface reconstruction in limbal stem cell deficiency rat model.Methods Human limbal cells were isolated and cultivated in vitro. Cytokertins 3, 12, and 19 (K3, K12 and K19) and p63 were detected by immunofluorescent staining or RT-PCR. BrdU labelling test was used to identify the slow cycling cells in the cultures. Limbal stem cell deficiency was established in rat cornea by alkali burn.Two weeks after injury, the rats received transplants of human limbal stem cells cultivated on amniotic membrane carrier. The therapeutic effect was evaluated by slit lamp observation, Hemotoxin and Eosin (HE) staining and immunofluorescent staining.Results On day 7 in primary culture, p63 and K19 were strongly expressed by most cells but only a few cells expressed K3. On days 14 and 21, p63 and K19 were still expressed by a majority of cells, but the expressive intensity of p63 decreased in a number of cells, while the proportion of K3 positive cells increased slightly and some cells coexpressed p63 and K3. RT-PCR showed that gene expression of both p63 and K12 were positive in cultivated limbal cells, but in mature superficial epithelial cells, only K12 was detected. BrdU labelling test showed that most cells were labelled with BrdU after 7 days‘ labelling and BrdU label retaining cells were observed after chasing for 21 days with BrdU free medium. For in vivo test, slit lamp observation, HE staining and immunofluorescent staining showed that the rats receiving transplant of human limbal stem cells cultivated on amniotic membrane grew reconstructed corneas with intact epithelium, improved transparency and slight or no neovascularization. A majority of epithelial cells of the reconstructed cornea were positive to antihuman nuclear antibody and cells expressing K3 were found mainly in superfacial epithelium.Conclusions Limbal stem cells can be cultivated in vitro: the cells are characterized by high proliferation and slow cycling and identified as p63/K19 positive and K3/K12 negative. During culture, some stem cells can proliferate and differentiate into mature cornea epithelial cells. Amniotic membrane is a suitable carrier for limbal stem cells. Transplantation of human limbal stem cells cultivated on amniotic membrane can functionally reconstruct rat cornea with limbal stem cell deficiency.     

兔角膜缘干细胞的体外培养、鉴定及形态学特点

目的 体外培养兔角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs),观察其生物学特性.方法 用含20%胎牛血清DMEM:F12(1:1)培养基对兔LSCs进行体外培养,倒置显微镜及HE染色观察培养细胞体外生长的形态,免疫细胞化学AE5和P63染色鉴定并进行图像分析,透射电镜观察超微结构特点.结果 培养2～3 d细胞从组织块游出,6～8 d形成良好的单层,细胞多呈圆形或卵圆形.电镜观察,培养7 d LSCs呈卵圆形,表面有少量微绒毛突起;胞质内细胞器少,核大,核仁明显,核浆比例大,部分细胞可见双核现象.免疫组化观察,培养第7天,大量细胞AE5免疫反应染色呈阴性,阳性细胞数量较少,大量细胞P63免疫反应染色呈阳性;培养第14天,AE5阳性细胞数明显增多,免疫反应染色增强,阳性细胞的平均灰度值显著降低(7 d:184.30±9.85,14 d:133.36±25.00,P<0.01).P63免疫反应阳性细胞数第14天与第7天相比明显减少,而阳性细胞的平均灰度值显著增高(7 d:108.13±17.96,14 d:177.59±7.86,P<0.01).结论 应用组织培养方法获得的原始细胞具有与体内正常LSCs相一致的形态特征;培养第7天为LSCs生长的峰值期.     

异种角膜缘上皮移植治疗碱烧伤动物的实验研究

[目的]观察异种角膜缘上皮早期移植对兔角膜碱烧伤的治疗效果。[方法]用鲤鱼角膜作异种角膜缘上皮移植的角膜来源，对角膜缘碱烧伤的兔动物模型进行异种角膜缘干细胞上皮移植术，观察术后新生血管长入角膜的情况以及基质中的炎症反应。[结果]异种角膜缘上皮移植术后，植片与植床粘附良好，基质中细胞浸润减轻，新生血管长入减少，实验组与对照组之间存在显著差异。[结论]异种角膜缘干细胞上皮移植术治疗角膜碱烧伤可减少角膜新生血管的形成，维持角膜缘的细胞屏障功能。     

兔角膜上皮——基质层组织工程方法三维重建

目的：利用细胞生物学和工程学原理在体外重建角膜上皮和基质层,提供与正常生理结构相似的模型。方法：兔角膜上皮和基质细胞原代并传代培养,免疫组化方法对细胞进行鉴定,以鼠尾为原料提取I型胶原溶液,重建角膜的基质和上皮,上皮实行气-液界面培养,倒置显微镜观察细胞形态。36h、72h、7d、14d、20d重建组织常规病理切片。结果：倒置显微镜下角膜成纤维细胞呈梭形三维生长,上皮细胞多层生长。组织病理检查显示重建的角膜组织结构类似于天然角膜组织。结论：本实验可为角膜的病理生理、毒理、药理以及基因表达等研究提供有利的模型和工具。