复合磷酸三钙／转血管生成素-1的骨髓间充质干细胞对骨修复及血管形成的实验研究

目的 研究转染Ang-1基因的骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合磷酸三钙(TCP)对骨缺损的修复及血管形成作用。方法 脂质体介导质粒pEGFP-N1-hAng-1转染兔BMSCs,与TCP复合,修复兔桡骨1.5 cm缺损模型。分别在2、4、8、12周取材,以组织学、免疫组化、核素扫描等方法检测骨修复及血管再生状况。结果组织学检查见转染细胞组毛细血管生长及新骨形成活跃,术后8、12周骨小梁体积(TBV％)由对照组21.67±6.28和40.18±9.57升至实验组42.17±8.93和67.54±15.29(P<0.05)。微血管密度(MVD)则由对照组10.18±3.54、14.28±5.03升至实验组15.23±5.67、19.64±6.47(P<0.05)。实验组99m锝(Tc)放射性计数在术后4、8、12周达到68.39±21.43、85.52±26.68、98.64±29.28,与对照组37.54±12.36、55.23±18.85、75.67±26.39组间差异有显著性(P<0.05)。结论 Ang-1转染细胞组较对照组血供加强,骨修复加速。与细胞因子局部定向释放,加强血管形成及骨代谢有关。利用基因转染技术结合组织工程有助于深入加强骨缺损的修复研究。     

复合血管生成素1基因及富血小板血浆的组织工程骨修复桡骨骨缺损

目的探讨以β磷酸三钙(β tricalcium phosphate,β-TCP)为支架,复合富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)和转染血管生成素1(angiopoietin1,Ang-1)基因的组织工程骨修复节段性骨缺损的能力。方法取兔股骨骨髓分离培养BMSCs,将Ang-1基因通过慢病毒转染至第2代BMSCs,转染后48h接种于β-TCP上培养,然后复合0.5mLPRP,制备复合PRP的组织工程骨。取20只3月龄新西兰大白兔制备双侧桡骨15mm骨缺损模型,采用自身对照,分别于每只动物左侧和右侧骨缺损处植入未转染Ang-1基因的组织工程骨(对照组)及转染Ang-1基因的组织工程骨(实验组)。术后行大体观察,于2、4、8、12周行X线片观察,取材行HE染色、免疫组织化学染色及生物力学检测。结果细胞转染48h后转染效率>90%,通过RT-PCR检测到转染细胞内Ang-1基因表达显著增高。术后所有动物患肢活动良好。X线片观察示实验组术后4周骨缺损处已有骨痂形成,8周有部分骨性愈合,12周骨缺损处完全骨性愈合;对照组至术后12周时无骨性愈合。HE染色示实验组术后8周有毛细血管出现,12周大量毛细血管生长于新生骨中;对照组8周未见新生毛细血管,12周见少量毛细血管。术后8、12周实验组微血管密度分别为(50.1±7.8)个/mm2和(66.1±3.5)个/mm2,对照组分别为0和(30.3±7.2)个/mm2;术后12周两组间比较差异有统计学意义(Z=—2.107,P=0.031)。免疫组织化学染色观察示术后8周实验组仍有Ang-1分泌。生物力学测试结果显示术后12周实验组三点弯曲试验和压缩试验的最大负荷均显著高于对照组(P<0.05)。结论复合PRP和转染Ang-1基因的组织工程骨修复兔桡骨节段性骨缺损后,组织工程骨内可形成新生血管,促进骨愈合。     

复合血管内皮祖细胞的组织工程骨在修复大段骨缺损实验中的血管化评价

目的 评价复合了血管内皮祖细胞(EPCs)的组织工程骨在修复兔桡骨大段骨缺损实验中的血管化情况.方法 自体骨髓通过不同方法的体外培养,获得EPCs及经成骨诱导的骨髓基质干细胞(BMSCs),与脱钙骨基质(DBM)构建组织工程骨修复兔桡骨大段骨缺损.用墨汁灌注、放射性核素骨显像、血管内皮细胞生长因子和Ⅷ因子相关抗原的免疫组化方法观察术后不同时期实验组(EPCs+BMSCs+DBM)、自身对照组(BMSCs+DBM)、阴性对照组(DBM)的骨组织血管化情况.结果 各组手术后2周骨缺损区新生血管数量增加,血流量开始升高,4周和8周时达到峰值,12周后开始下降.实验绀的新生血管数量和局部血流量在术后2、4、8周明显高于自身对照组和阴性对照组,血管排列更整齐.结论 复合EPCs的组织工程骨在修复大段骨缺损时,能促进早期血管化,从而进一步促进成骨.     

骨髓基质干细胞联合血管束植入构筑血管化组织工程骨修复兔大段骨缺损

目的 研究兔骨髓基质干细胞(BMSCs)联合动静脉血管束植入异种脱蛋白松质骨(XDCB)构筑血管化组织工程骨修复兔桡骨中远段完全骨膜骨缺损的能力. 方法 从兔髂嵴捕骨髓培养制备兔BMSCs,将第5代BMSCs种植于多孔XDCB,并进行成骨诱导2周制备组织工程骨,手术中分离兔桡动、静脉血管束.动物模型为制备24只兔舣侧桡骨中远段完全骨膜骨缺损1.5 cm共48侧,分4组修复(n=12),A组为空白未治疗组,B组为单纯材料+血管束植入组(XDCB+VB),C组为组织工程骨组(XDCB+BMSCs),D组为组织工程骨+血管束植入组(XDCB+BMSCs+VB),符组交叉配对.分别于术后4、8、12周行X线片、大体解剖、组织切片、生物力学等检查,观察各组骨缺损修复效能及移植物血管化情况.结果 D组骨缺损修复效能(术后12周新骨面积比2.02%±0.16%)及血管化情况(术后12周血管面积比6.89%±0.32%)优于C组(1.50%±0.28%和3.17%±0.19%),而C组又优于B组(1.59%±0.19%和6.52%±0.23%),A组骨缺损未修复,各组结果差异有统计学意义(P<0.05).结论 BMSCs联合动静脉血管束植入构筑的血管化组织工程骨能促进成骨过程和新生骨的血管化,显著提高组织工程骨修复大段骨缺损的能力.     

转染Ang-1间充质干细胞加强兔骨缺损修复的实验研究

目的 研究转染血管生成素-l(angiopoiten—1．Ang—1)基因的骨髓间充质干细胞(bone-mesenchvmal stem cells，BMSCs)对免骨缺损的修复作用。方法以脂质体介导pCDNA3．Ang—1质粒转染体外分离培养的兔BMSCs，与TCP陶瓷复合，修复兔桡骨15mm长节段性骨缺损?以未转染细胞作对照，进行电镜、组织学及核素扫描等方法检测骨修复情况。结果细胞与TCP材料复合后生长良好。组织学检查见转染细胞组毛细血管生长及新骨形成活跃，核素扫描见实验组局部血供丰富、代谢旺盛。结论Ang—l转染细胞组血供增加和骨修复加速，与细胞因子局部定向释放，加强血管形成及骨代谢有关。Ang—1修饰的BMSCs预构人工骨有助于加速骨缺损的修复?     

引导骨再生技术对血管化组织工程骨修复兔股骨缺损过程中骨形态发生蛋白-2成骨及表达的影响

目的 探讨引导骨再生(GBR)技术对血管化组织工程骨修复兔股骨缺损过程中局部骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的成骨量及表达的影响,以明确GBR技术在血管化组织工程骨应用中的作用. 方法 将兔自体骨髓基质干细胞经诱导后与β-磷酸三钙材料复合,植入制备的兔股骨缺损处并在材料侧槽中植入股动静脉束,其中实验组9例,血管化组织工程骨用可吸收性GBR屏障膜包裹;对照组9例,单纯植入血管化组织工程骨,分别于术后4、8、12周通过形态学检测新生骨量,ELISA法检测骨缺损局部BMP-2的表达量. 结果 随着时间进展各组成骨量逐渐增加(实验组4、8、12周时新生骨的相对面积比分别为7.31%±0.55%,35.23%±3.07%,76.09%±3.71%,对照组4、8、12周时新生骨的相对面积比分别为17.26%±1.17%,54.50%±4.26%,82.57%±4.11%,差异均有统计学意义(P<0.05);且同一时间点实验组成骨量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);术后4、8、12周时实验组骨缺损局部BMP-2 OD值分别为0.334±0.012,0.245±0.008,0.172±0.009,对照组骨缺损局部BMP-2 OD值分别为0.389±0.008,0.289±0.008,0.189±0.009;术后4周时两组骨缺损内BMP-2表达量均达峰值,此后即开始出现不同程度的下降;术后4、8、12周时骨缺损局部BMP-2表达量实验组均低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 GBR屏障膜会降低血管化组织工程骨修复兔股骨缺损局部的成骨量,并减少骨缺损过程中局部BMP-2的表达量.     

近交系小耳猪骨复合骨髓基质干细胞修复节段性骨缺损

目的 探讨近交系小耳猪骨复合骨髓基质干细胞(BMSCs)修复节段性骨缺损的可行性. 方法 将BMSCs与版纳近交系小耳猪松质骨在体外联合培养,兔桡骨中上段制成1.5 cm的骨.骨膜缺损模型,实验组植入复合异种骨,对照组植入单纯异种骨,空白对照组不植入任何材料,分别于术后4、8、12周各时间点行标本的大体观察、组织学观察、X线片观察、SPECT扫描及骨密度测试,比较其骨缺损区骨修复愈合情况.结果 术后第12周,实验组骨缺损区完全修复,骨密度接近正常;对照组骨缺损区修复缓慢,新骨形成量少;空白对照组骨缺损区未修复. 结论 近交系小耳猪骨复合BMSCs修复节段性骨缺损能力强,在成骨速度和量上明显优于单纯异种骨.     

局部注射促血管生成素2调控自噬促进体内组织工程人工骨早期血管化和骨缺损修复的研究

目的探讨兔桡骨骨缺损处局部注射促血管生成素2(angiopoietin 2,Ang-2),通过调控自噬促进组织工程人工骨早期血管化和骨缺损修复的机制。方法取48只新西兰大白兔,构建单侧1.5 cm长桡骨缺损模型,于骨缺损处植入羟基磷灰石/胶原支架后,随机分为两组,对照组(A组)和Ang-2组(B组)分别于术后2周内每日于骨缺损处注射1 m L生理盐水和1 m L溶于生理盐水的400 ng/m L Ang-2。采用Western blot检测骨痂区自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 lightchain 3,LC3)和Beclin-1,血管生成相关蛋白VEGF及自噬降解底物蛋白SQSTMl/p62的表达。术后4、8、12周行X线片检查,采用LaneSandhu X线评分法对骨缺损修复情况进行评分;术后12周处死动物取标本行大体观察,采用HE染色观察骨缺损区血管生成情况。结果 Western blot检测示,B组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1及VEGF相对表达量高于A组,SQSTMl/p62相对表达量低于A组,差异均有统计学意义(P0.05)。影像学及标本大体观察示A组仅有少量骨痂生成,但骨缺损未修复;B组新生骨痂较多,骨缺损处完全修复。术后4、8、12周B组Lane-Sandhu评分均显著高于A组(P0.05)。HE染色示B组哈佛管排列整齐,新生血管显著多于A组,差异有统计学意义(t=–11.879,P=0.000)。结论局部注射适宜浓度Ang-2可能通过增强自噬促进兔体内组织工程人工骨早期血管化和骨缺损修复。     

转血管内皮细胞生长因子基因干细胞结合珊瑚羟基磷灰石修复兔骨缺损的实验研究

目的探讨珊瑚羟基磷灰石（CHA）结合转血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨修复兔骨缺损的效果。方法 以CHA作为转VEGF基因骨髓间充质干细胞（BMSCs）的可吸附载体,体外构建组织工程骨,将其植入兔尺骨中段10mm骨缺损处,以CHA/BMSCs、自体骨移植组和空白组作为对照,在术后2、4、8、12周进行大体解剖、X线摄片、病理组织切片、生物力学测试,观察各组骨愈合程度及力学强度。结果 术后8周病理组织切片及X线摄片显示实验组骨缺损基本修复,效果优于对照组。生物力学测试显示术后12周组织工程骨组组抗扭转强度优于自体骨移植组。结论 CHA结合转VEGF基因BMSCs构建组织工程骨可用于骨缺损修复,优于自体骨移植组。     

血管束植入组织工程骨修复兔股骨缺损对血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨血管束植入组织工程骨修复兔股骨缺损对局部血管内皮生长因了(VEGF)表达的影响.方法 将兔自体骨髓基质下细胞经诱导后与β-磷酸三钙材料复合,植入制备的兔股骨缺损处,其中实验组在材料侧槽中植入股骨的动静脉血管束,对照组则单纯植入组织工稗骨,分别于术后2、4、8、12周通过形态学检测新生骨量,免疫组织化学方法检测新生骨中VEGF的表达量.结果 随着时间进展,各组成骨量逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05),并且从第4周开始实验组成骨量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);符时问点实验组新生骨中VEGF的表达最均高于对照组,差异有统汁学意义(P<0.05),且4周时达到最人值.结论 血管束植入组织工程骨可明显增加新生骨中VEGF的表达并能促进骨缺损的修复.     

重组合异种骨植骨修复骨囊肿所致骨缺损

2001年10月～2003年9月，笔者共收治28例骨囊肿患者，均采用病灶刮除，瘤腔灭活和重组合异种骨植骨治疗，获得满意疗效，体会如下。     

骨搬运治疗四肢大段骨缺损的临床研究

目的 探讨应用骨搬运治疗四肢大段骨缺损的临床疗效.方法 骨搬运治疗四肢大段骨缺损29例,男23例,女6例;年龄18~53岁,平均30岁;骨缺损5~16cm,平均7.5cm.术前均摄双侧肢体等条件X线片,测量并记录骨缺损的长度,对于合并软组织缺损者在清创前后分别记录创面缺损面积.均在截骨术后10~14d开始骨搬运,每天4~6次,每次1/6~1/4mm.记录术后骨痂牵拉时间、骨痂直径率(CDR)、骨愈合时间、支架固定时间及活动功能情况,分析并进行疗效评定.结果 随访18~31个月,平均24个月.18例移植皮瓣全部成活,伤口一期愈合.在骨搬运过程中,因牵拉皮肤导致不适而行皮肤切开调整:15例为一次,10例为两次,4例为三次.骨搬运时间45~158d,平均76.2d.根据CDR值及时调整牵拉速度,22例CDR≥85%,5例80%≤CDR<85%,2例CDR<80%.骨愈合时间5~14个月,平均8.7个月.外固定支架携带时间6~18个月,平均10.1个月.根据Paley等方法评价骨搬运结果及功能.骨搬运结果评价:优25例,良4例;功能评价:优15例,良10,可4例,优良率86.2%.结论 应用Orthofix重建外固定架进行骨搬运是治疗四肢大段骨缺损的有效方法.骨搬运的起始速率为1mm/d,后根据CDR值及时调整,如CDR>85%,可加快为1.2mm/d;如CDR<80%,可减缓为0.5mm/d.     

Long bone nonunions treated with autologous concentrated bone marrow-derived cells combined with dried bone allograft

Introduction

Nowadays the treatment of long bone nonunion continues to be one of the most complex and debated topics due to the large number of failures. For several years, in the relevant literature three factors have been considered essential in the healing process: growth factors and hormones, osteoprogenitor cells (mesenchymal stem cells), and extracellular matrix. The mechanical stability of the fracture site is considered the fourth element of the “Diamond concept theory.” The aim of our study was to evaluate the validity of biological adjuvants of mechanical synthesis allowing a faster healing process of nonunions.

Materials and Methods

We dealt with 19 patients with long bone nonunion. All patients have been treated with concentrated mesenchymal stem cells without bone autologous transplant. We used the Extracell BMC-marrow aspirate protocol of Regen Lab. The radiographic parameters taken into account for the diagnosis of successful healing were the presence of a bridge callus, obliteration of the fracture line and bone cortical continuity. Clinically, the pain was investigated with VAS score (visual analogue scale), where zero means no pain and 10 the worst possible pain.

Results

Radiographic investigation shows complete healing in 78.9 % (15 cases) with an average time to healing of 6.5 months (minimum healing time 80 days) corresponding also in complete remission of clinical symptoms.

Conclusion

The use of growth factors and autologous mesenchymal stem cells through the enforcement of system for tissue regeneration is a valid and innovative biotechnology technique for the treatment long bone nonunions.     

骨胶原与骨质疏松骨密度及骨生物力学的相关性研究

目的探讨骨胶原含量在绝经后骨质疏松症的发生、发展及在骨质疏松性骨折中的作用。方法取7个月龄未交配雌性SD大鼠60只，随机分为四组，A组：对照组（sham组）；B组：切除卵巢组；C组：切除卵巢＋雌激素治疗组；D组：切除卵巢＋降钙素治疗组。除A组外，其他三组通过切除双侧卵巢法12周后制成骨质疏松模型，24周后分别行k的力学特性、右侧股骨三点弯曲试验、羟脯氨酸含量、k骨密度（BMD）测定，Masson三色染色法显示骨胶原形态。结果A、C、D组与B组在k羟脯氨酸含量、BMD、k压缩力学参数值、右侧股骨生物力学参数值、骨胶原染色含量及形态方面差异均有统计学意义（P〈0．05），而A、C、D组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。统计学分析显示羟脯氨酸含量与BMD及骨生物力学参数值呈直线相关性。结论骨质疏松的发生与骨胶原含量下降有关。骨胶原含量的下降与BMD降低及骨生物力学改变呈相关性。应用雌激素和降钙素治疗去势后骨质疏松大鼠，不仅可以提高其BMD含量和骨生物力学性能，而且还可以提高骨胶原的含量。     

Repair of long bone defects with demineralized bone matrix and autogenous bone composite

Background:

Repair of diaphyseal bone defects is a challenging problem for orthopedic surgeons. In large bone defects the quantity of harvested autogenous bone may not be sufficient to fill the gap and then the use of synthetic or allogenic grafts along with autogenous bone becomes mandatory to achieve compact filling. Finding the optimal graft mixture for treatment of large diaphyseal defects is an important goal in contemporary orthopedics and this was the main focus of this study. The aim of this study is to investigate the efficacy of demineralized bone matrix (DBM) and autogenous cancellous bone (ACB) graft composite in a rabbit bilateral ulna segmental defect model.

Materials and Methods:

Twenty-seven adult female rabbits were divided into five groups. A two-centimeter piece of long bone on the midshaft of the ulna was osteotomized and removed from the rabbits’ forearms. In group 1 (n=7) the defects were treated with ACB, in group 2 (n=7) with DBM, and in group 3 (n=7) with ACB and DBM in the ratio of 1:1. Groups 4 and 5, with three rabbits in each group, were the negative and positive controls, respectively. Twelve weeks after implantation the rabbits were sacrificed and union was evaluated with radiograph (Faxitron), dual-energy x-ray absorptiometry (DEXA), and histological methods (decalcified sectioning).

Results:

Union rates and the volume of new bone in the different groups were as follows: group 1 - 92.8% union and 78.6% new bone; group 2 - 72.2% union and 63.6% new bone; and group 3 - 100% union and 100% new bone. DEXA results (bone mineral density [BMD]) were as follows: group 1 - 0.164 g/cm², group 2 - 0.138 g/cm², and group 3 - 0.194 g/cm².

Conclusions:

DBM serves as a graft extender or enhancer for autogenous graft and decreases the need of autogenous bone graft in the treatment of bone defects. In this study, the DBM and ACB composite facilitated the healing process. The union rate was better with the combination than with the use of any one of these grafts alone.