人染色体8p11.2亚带ANK1位点附近区域表达序列的分离与克隆

目的分离人染色体８ｐ１１．２亚带ＡＮＫ１位点附近区域基因的表达序列。方法采用ｃＤＮＡ选择法从定位于该区域的人工酵母染色体（ＹＡＣ）中分离基因的表达序列，并从分离的表达序列中选取１个序列用于筛选人胎脑ｃＤＮＡ文库。结果获得７个表达序列，其中５个可与目的ＹＡＣ反杂交。所得的表达序列ＢＨＬＣ１５２与鼠的ＣＡｒＧ盒结合因子基因高度同源，ＢＨＬＣ７４与编码心室肌肌球蛋白的碱性轻链１（ＭＬＣ１）基因高度同源，表明ＢＨＬＣ７４可能编码一种ＭＬＣ１的同工蛋白。分离的其它表达序列与数据库内一些位置和功能尚不清楚的表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｅｄｓｅ－ｑｕｅｎｃｅｔａｇ，ＥＳＴ）仅有部分同源性。用表达序列ＢＨＬＣ１１９筛选人胎脑ｃＤＮＡ文库，获得１个插入片段长１９５１ｂｐ的克隆，序列分析表明它编码１７４个氨基酸，该序列与所有已知的蛋白质序列无同源性。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析结果显示，在人胎脑总ＲＮＡ中呈现１条约３．５ｋｂ带；组织表达分析表明，此系一广泛表达的基因。结论ＢＨＬＣ７４可能作为与８ｐ相关的心脏病候选基因，其它序列至少可以作为定位在ＡＮＫ１位点附近区域的肿瘤抑制基因的初筛基因。     

饰胶蛋白（Decorin）基因的cDNA克隆与表达

目的 通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因ｃＤＮＡ克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法 应用ＰＣＲ技术从Ｔ细胞ｃＤＮＡ文库获得饰胶蛋白全长基因ｃＤＮＡ片段。并克隆到ｐＵＣ１９载体中,采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测定全部ｃＤＮＡ序列,将测序正确的饰胶蛋白ｃＤＮＡ序列插入ｐＧＥＸ－４Ｔ－１表达载体中,经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后１．２％凝胶电泳鉴定,ＩＰＴＧ诱导表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果 克隆的饰胶蛋白ｃＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中ＡＦ１３８３００记载的序列完全一致,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值（６５．６ＫＤ）也一致并为可溶性蛋白。结论 本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了ＧＳＴ－Ｄｅｃｏｒｉｎ融合蛋白。     

未知人Na( )-K( )-Exchanging ATPase α1亚基基因第一内含子的获得及鉴定

目的研究人Ｎａ（＋）－Ｋ（＋）－ＥｘｃｈａｎｇｉｎｇＡＴＰａｓｅα１亚单位基因胞外区约８０～１３０位氨基酸编码序列的未知基因组结构。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法对人基因组ＤＮＡ及ｃＤＮＡ文库进行扩增,限制性酶切分析扩增产物,并进行荧光测序,对测序结果进行同源性分析及剪接位点的搜索并对得到的核苷酸序列进行分析。结果人基因组ＤＮＡ和ｃＤＮＡ经扩增后分别得到８３３和１９５ｂｐ两种不同大小的片段Ｆｇ,Ｆｃ。分析序列发现Ｆｇ与Ｆｃ相比在１３８～７７５ｂｐ处含有一６３８ｂｐ的插入片段,此片段与ＧｅｎＢａｎｋ中的任何已知序列均无明显同源性。结论本研究发现了一段全新未知的人Ｎａ（＋）－Ｋ（＋）－ＥｘｃｈａｎｇｉｎｇＡＴＰａｓｅα１亚单位基因的内含子全序列,并得到了第一外显子同第二外显子之间的相对位置和序列,其在Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ的基因检索号为Ｌ７６９３８。序列分析表明该内含子可能具有潜在的调控基因表达的功能,并含有一个可能的编码序列。     

日本血吸虫尾蚴(中国大陆株)表达序列标签的获取及同源性分析

目的 了解日本血吸虫尾蚴ｃＤＮＡ文库中基因的基本情况,为新基因的筛选鉴定提供依据。方法 日本血吸虫尾 蜘ｃＤＡＮ文库中的噬菌体侵入大肠杆菌ＢＭ２５．８后环化成质粒。筛选出已转入质粒的菌株。提取质粒ＤＮＡ,用质粒上 的一段测序引物序列进行一次性测序,得到一个表达序列标签（ＥＳＴ）。通过ＢＬＡＳＴｘ及ＢＬＡＳＴｎ公共数据库经编辑分 析的ＥＳＴ序列进行同源性比较。经过分析编辑后的新ＥＳＴ序列,以编写好的程序和Ｅ－ｍａｉｌ方式递交,以获得ＧｅｎＢａｎｋ 登录号。通过对同源性比较结果的总结,对该文库的基本情况进行分析。结果与结论 在测出的５８个ＥＳＴ中有３个核 苷酸序列与日本血吸虫已知基因高度同源,有２个核苷酸序列与曼氏血吸虫较高度同源,有７个ＥＳＴ的蛋白质序列与 其他物种有较高同源性而核苷酸序列同源性很低,有２７个ＥＳＴ的蛋白质及核苷酸序列同源性都很低。     

K562细胞定向表达cDNA文库的快速构建

采用一步法快速从培养的Ｋ５６２细胞中抽提、纯化ｍＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ分子后，通过在ｃＤＮＡ分子两端加ＥｃｏＲＩ适配子、Ｔ４多核苷酸激酶作用下磷酸化、ＮｏｔＩ内切酶消化、过ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ柱等步骤，与λＥｘＣｅｌｌ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ载体连接，然后用包装蛋白在体外包装连接产物，感染Ｅ·ＣｏｌｉＮＭ５２２以构建ｃＤＮＡ文库。经检测：该文库含有１．０×１０６个重组子，ｃＤＮＡ分子长度在０．４～８．５ｋ６范围，扩增后的滴度达１．２×１０１０ｐｆｕ／ｍｌ，完全达到筛选低表达基因的要求，为从Ｋ５６２细胞中克隆新的锌指蛋白ｃＤＮＡ基因奠定了基础。并对构建ｃＤ－ＮＡ文库的关至和应用进行了讨论     

人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的建立

建立人树突状细胞（ＤＣ）的ｃＤＮＡ文库,通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体外经ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－４培养,扩增出高纯度的ＤＣ,抽取纯化ｍ ＲＮＡ,转录成ｃＤＮＡ,定向插入ｐＳＰＯＲＴ２．０载体,建立人ＤＣ的ｃＤＮＡ 质粒文库;用ＡＢＩ３７７全自动测序仪对该文库进行同源性比较,筛选出代表未知基因ＥＳＴ,然后在ＧＣＧ 软件中进行分析,对重要的未知ＥＳＴ克隆其全长ｃＤＮＡ。结果：所扩增的ＤＣ经流式细胞仪分析高表达ＭＨＣ－Ⅰ,ＭＨＣ－Ⅱ,Ｂ７,ＣＤ１ａ 和ＣＤ８３等表面标志,能强烈刺激同种异体Ｔ淋巴细胞的体外增殖反应;建立的ＤＣｃＤＮＡ 文库９２％ 以上克隆有平均１．６ ｋｂ 大小的插入片段;从所测的１２ ０００余条ＥＳＴ中筛选出代表未知基因的３ ０００余条,克隆到１０９条全长新基因,包括属于细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和粘附分子等家族的免疫新分子,部分全长基因已在Ｇｅｎｅｂａｎｋ 中登录。结论：成功建立了人ＤＣ的ｃＤ－ＮＡ 基因文库及其大规模随机测序体系,并克隆到免疫分子。建立人树突状细胞（ＤＣ）的ｃＤＮＡ文库,通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体     

LHScDNA的部分克隆及其表达对肝癌细胞行为的影响

目的：克隆在肝癌组织中低表达的差异显示片段Ｌ２的基因ｃＤＮＡ序列,并初步探讨其在肝癌发生、发展过程中的作用。方法：将Ｌ２在ＧｅｎＢａｎｋ中拼接后,分析其序列结构,并构建正义真核表达质粒,转染ＢＥＬ－７４０２肝癌细胞后,对转染细胞增殖、粘附、迁移和侵袭等指标进行测定。结果：克隆得到一条１００５ｂｐ的ｃＤＮＡ,其５’端７１２ｂｐ与人Ｌｉｐｒｉｎβ１ｃＤＮＡ５’端调控序列和外显子１,２,３序列同源（１００％）,而３’端２９３ｂｐ与Ｌｉｐｒｉｎβ１基因内含子４同源（１００％）。其间有一个５１０ｂｐ开放阅读框架,起始密码位置与Ｌｉｐｒｉｎβ１基因相同,推断的蛋白产物除Ｃ端１３个氨基酸残基外,其余均与Ｌｉｐｒｉｎβ１同源。此ｃＤＮＡ暂命名为ＬＨＳ（Ｌｉｐｒｉｎβ１－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）。ＬＨＳ ｃＤＮＡ     

人脑胶质细胞来源神经营养因子基因的克隆及测序

为研究人脑胶质细胞来源的神经营养因子（ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ, ＧＤＮＦ） 在神经系统疾病中的作用,根据ＧＤＮＦ 的ｃＤＮＡ 序列设计并合成引物,以流产胎儿脑组织为来源,分别提取ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 作模板,经ＲＴ ＰＣＲ 和ＰＣＲ 技术扩增人ＧＤＮＦ 基因片段,采用ＤＮＡ 重组技术将其克隆于ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ 载体中并测序。结果：ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 体外扩增得到的片段均是４１０ ｂｐ ,两者无差异。ＰＧＥＭ ＧＤＮＦ 经酶切鉴定正确,测序结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ 比较基本相同。由于ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 扩增得到的片段大小相同,证实该基因片段内无内含子插入,该片段可用于真核及原核表达。     

HP8：增强子结合蛋白家族的一个新基因的cDNA克隆

以大鼠增强子结合蛋白（Ｃ／ＥＢＰ）ｃＤＮＡ为探针，筛选人胎肝ｃＤＮＡ库，得到一个含有２４８０碱基命名为ＨＰ８的ｃＤＮＡ克隆，其中８４－１１０９位碱基属编码区。经基因数据库（ＥＭＢＬ，９５．６版本）查对未发现同源基因。该基因编码的蛋白Ｃ－末端含有亮氨酸拉链结构，和Ｃ／ＥＢＰ功能区（Ｃ／ＥＢＰ基因家族新成员。基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实该基因为单拷贝基因。在１４种胎儿组织中显示小肠、皮肤高表达，肾     

含hBDNF cDNA和HTH_1 cDNA两个转录单位表达质粒的构建及在CHO细胞的表达

在ＣＨＯ细胞同时表达ｈＢＤＮＦ和ＨＴＨ１ｃＤＮＡ两个外源基因。方法构建同时含ｈＢＤＮＦｃＤＮＡ和ＨＴＨ１ｃＤＮＡ两个转录单位的表达质粒并转染ＣＨＯ细胞,筛选出同时表达ｈＢＤＮＦ和ＨＴＨ１的克隆命名为ＣＨＯｈＢＤＮＦＨＴＨ１细胞;用双重免疫组化、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ及活性测定等方法检测外源ＨＴＨ１、ｈＢＤＮＦ基因在ＣＨＯｈＢＤＮＦＨＴＨ１细胞的表达。结果ｈＢＤＮＦ、ＨＴＨ１同时在ＣＨＯｈＢＤＮＦＨＴＨ１细胞得到表达;ＨＰＬＣ－ＥＣＤ法检测到ＣＨＯ－ｈＢＤＮＦ－ＨＴＨ１细胞培液中Ｌ－ＤＯＰＡ含量为每２４ｈ（２５．３±６．７）ｎｇ／１０６ｃｅｌｓ;ＣＨＯ－ｈＢＤＮＦ－ＨＴＨ１细胞培液可明显促进人胚脊神经根节细胞的存活和生长。结论采用多基因表达技术可以使ｈＢＤＮＦ和ＨＴＨ１ｃＤＮＡ两个外源基因同时在一个细胞中得到表达,而且表达的ｈＢＤＮＦ、ＨＴＨ１具有生物学活性     

肝癌细胞表达差异cDNA克隆的研究

目的：筛选肝细胞癌(HCC)相关基因，探讨其在HCC发病中的临床意义。方法：用差异显示技术对比研究正常肝组织，胎肝组织，HCC组织及癌旁肝组织之间mRNA的表达差异，以肝癌cDNA片段MRG8．2为探针，对10例HCC及癌旁肝组织进行斑点印渍分析，并通过逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)方法检测这些标本血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达水平。结果：获得55个HCC差示cDNA片段，其中24个cDNA片段同时表达于HCC和胎肝组织cHCC差示片段MRG98．2在7例HCC标本中表达阳性(7／10)，癌旁肝组织弱表达(2／10)或元表达。VEGFmRNA在7例MRG98．2阳性表达的HCC标本中6例表达上调。结论：胚胎期某些基因的激活与HCC发生有关，差示片段MRG98．2可能是HCC相关的基因片段，其表达与VEGFmRNA一致，并可能与肿瘤浸润转移及顶后不良有关。     

Biological function of a novel gene overexpressed in human hepatocellular carcinoma

Objective To clone the full-length of a differentially expressed cDNA fragment, LC27, and study its biological function tentatively. Methods Northern blot was used to analyze the expression pattern of LC27 in hepatocellular carcinoma, matched nontumor liver tissues, fetal liver and normal adult liver tissues, as well as BEL-7402 hepatocellular carcinoma cell line ESTs splicing and 5’ rapid amplification of cDNA ends (5’ RACE) were used to clone the full-length of LC27 cDNA.An antisense oligodeoxynucleotide approach was used to investigate the biological role of the gene in the proliferation of BEL-7402 cells. Results A 2186 bp novel cDNA with an open reading frame encoding a 283 amino acid protein was cloned.Analysis of the deduced amino acid sequence indicated that it is 38% (88/229) identical to human Golgi 4-transmembrane spanning transporter MTP.The gene and the encoded protein was termed hepatocellular carcinoma overexpressed transmembrane protein (hotp) and HOTP, respectively.Hotp mRNA was almost undetectable in normal adult liver and fetal liver tissues.However, it was significantly up-regulated in hepatocellular carcinoma and some matched nontumor liver tissues, as well as BEL-7402 cells.The proliferation of BEL-7402 cells was suppressed by an antisense oligodeoxynucleotide against hotp mRNA at a concentration of 50 μg/ml. Conclusion HOTP may be an integral membrane transporter protein.The overexpression of the gene in hepatocellular carcinoma may play an important role in hepatocarcinogenesis and disease progression.     

HP8: The cDNA clone of a novel member of C/EBP gene family

ＨＰ８：ＴｈｅｃＤＮＡｃｌｏｎｅｏｆａｎｏｖｅｌｍｅｍｂｅｒｏｆＣ／ＥＢＰｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ￥（徐砺新）（万大方）（刘彦仿）（李宏年）（张萍萍）（隋延仿）（顾健人）ＸｕＬｉｘｉｎ，ＷａｎＤａｆａｎｇ，ＬｉｕＹａｎｆａｎｇ，ＬｉＨｏｎｇｎｉａｎ，Ｚｈ...     

增强子结合蛋白家族的新基因HP8的部分cDNA克隆

探讨人的增强子结合蛋白（Ｃ／ＥＢＰ）相关基因。方法以大鼠Ｃ／ＥＢＰｃＤＮＡ为探针，筛选人胎盘ｃＤＮＡ文库。结果得到一个含有１９７５碱基命名为ＨＰ８的ｃＤＮＡ克隆，其中１～６０４位碱基属编码区。经基因数据库查对未发现同源基因。该基因编码的蛋白Ｃ－末端含有亮氨酸拉链结构（ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｓｔｒｕｃｅｕｒｅ）和Ｃ／ＥＢＰ功能区（Ｃ－末端６０个氨基酸）同源性高达９７％，而上游编码区则与Ｃ／ＥＢＰ及其已知家族同源性很低，表明该基因属Ｃ／ＥＢＰ基因家族新成员。基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实该基因为单拷贝基因。在１４种胎儿组织中显示小肠、皮肤高表达，肾上腺中度表达，肝、肺、肾、甲状腺、胆囊低表达。在３例正常成人肝组织中仅１例低表达，而在５对肝癌及癌旁肝组织中显示２例癌组织及１例癌旁组织高表达。结论以上结果提示该基因可能与细胞增殖有关。     

人B淋巴细胞活化相关新基因的克隆

目的：分离新的与B细胞活化相关基因。方法：采用差异显示反转录PCR（DDRT－PCR）技术对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异表达进行分析。差异显示的片段经过Northern杂交验证后,作为探针进行人活化B细胞cDNA文库的筛选。结果：差异显示分析共获得明显的差异表达的标签序列(expressed sequence tag,EST)62条,其中主要在静止B细胞表达的有32条,在活化B细胞表达的有30条,经Northern 杂交验证,共获得阳性的片段25条,以在活化B细胞中高表达的EST30为探针,经3轮筛选人活化B细胞文库后获得1个新的全长为2048bp的cDNA克隆,该克隆含有1个630bp的开放读码框,其推断的氨基酸序列N端与酵母的动力蛋白KAR3部分同源,结论：克隆了1条可能与B细胞活化相关的新基因。     

肝癌相关基因HCCA2的克隆及其与肝癌的相关性研究

目的　研究和克隆新的肝癌相关基因,探索肝癌发生的分子基础。方法　采用mRNA差异显示技术,分析肝细胞癌和癌旁组织间基因的差异表达情况,获得差异表达基因片断。用此基因片断作为探针,通过筛选胎盘cDNA文库,以获得该基因cDNA全长,并用Northern印迹杂交的方法,分析所获得的新基因在43对肝细胞癌、对应癌旁组织中的差异表达和在正常组织中的分布。结果　克隆了一个新的肝癌相关基因HCCA2的全长cDNA,其在人体正常组织中分布较为广泛,在正常肝组织中不表达。该基因在43对肝癌组织中表达的阳性率是79%(34/43)。它的表达与肝癌包膜的完整性、Ki-67蛋白的表达相关（P<0.01）。结论　肝癌差异表达新基因HCCA2可能与肝癌细胞的浸润和增殖能力有关。     

Cloning and characterization of a novel gene encoding a putative seven-span transmembrane protein localized in endoplasmic reticulum

To clone and analyze the structure of a novel gene, named EST-1 (endoplasmic reticulum-localized seven-span transmembrane protein-1) and to analyze the expression pattern and intracellular location of EST-1. Methods:The cDNA library was screened to isolate novel cDNA fragment. The structure of novel gene was analysed by computer software. Expression of EST-1 was analyzed by dot blot and Northern blotting, Intracellular localization was observed after EST-1-enhanced green fluorescence protein (EGFP) fusion gene was transfected into mammalian cells. Results: The full-length cDNA of mouse EST-1 was 1 802 bp, with a 1 293 bp open reading frame encoding 431 amino acids. It was predicated that protein encoded by FST-1 contained a signal peptide sequence at the N-terminus, seven putative transmembrane domaius,and an ER-retaining signal at the C-terminus, EST-1-EGFP fusion protein showed an ER-like intracellular distribution in mammalian cells. Expression pattern analysis showed that EST-1 is expressed in all tissues examined. Conclusion: EST-1 is encoding a putative seven-span transmembrane protein localized in endoplasmic retieulum. EST-1 was expressed in all tissues examined, suggesting an essential function of EST-1 in cells.     

人泛素结合酶cDNA的分离与克隆

目的 分离、克隆人泛素结合酶基因,并初步研究其组织表达谱。方法 根据与鼠泛素结合酶有较高一致性的人表达序列标签（ＥＳＴ）设计筛库引物,筛选人胎脑ｃＤＮＡ文库,采用生物信息学方法分析筛选到的阳性克隆;设计控针,应用人多组织杂交膜分析该基因的组织表达谱。结果 从文库中筛选到两个互为剪接异构体的长度分别为１ ４７１和１ ３１５ｂｐ的ｃＤＮＡ克隆,其开放读码分别编码１４７和１０９个氨基酸,与鼠、果蝇、线虫