衔接蛋白2基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的：构建针对衔接蛋白2的μ2亚单位(AP2-μ2)的短链干涉RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对AP2-μ2基因的干涉作用。方法：设计AP2-μ2靶向的发夹状siRNA,据此设计合成3条互补的寡核苷酸链,退火后分别连接到pSilencer 3.1 neo H1载体,转化扩增后进行序列测定。待转染细胞分为对照组、Scramble plasmid、AP2 plasmid-1、AP2 plasmid-2和AP2 plasmid-3组。用脂质体转染法将3组siRNA重组质粒与阴性对照质粒(Scramble plasmid)转染大鼠心肌细胞株H9C2,通过RT-PCR法检测AP2-μ2基因表达水平的变化。结果：合成的6条寡核苷酸单链凝胶电泳显示多个电泳条带,分别退火后,产物经凝胶电泳显示形成单一条带。双链DNA模板与载体质粒连接后,用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切,凝胶电泳可见4　300和66 bp的酶切片段。DNA测序连接的核酸序列与设计序列一致,表明AP2-μ2基因的3条siRNA载体构建成功。RT-PCR检测,在AP2 plasmid-1组,转染的H9C2细胞中AP2-μ2的基因表达水平较阴性对照组降低约96%。结论：成功地构建了针对AP2-μ2基因的3条siRNA载体,其中AP2 plasmid-1转染细胞后可显著抑制AP2-μ2基因表达。     

RNA干扰抑制α3神经型尼古丁受体的表达对SH-SY5Y神经细胞抗氧化能力的影响

目的：探讨通过RNA干扰技术抑制α3神经型尼古丁受体（nAChR）基因表达后该受体对神经细胞抗氧化能力的影响,了解α3nAChR的神经保护作用。方法：设计并体外合成α3nAChR的特异性编码siRNA序列的寡核苷酸,退火后克隆至pSilencer 3.1-H1neo质粒中,构建重组质粒α3nAChR pSilencer3.1-H1neo。将α3nAChR pSilencer 3.1-H1neo转染SH-SY5Y细胞,用含G418的培养液筛选,挑选阳性克隆后采用即时荧光定量PCR和Western blot方法检测转染细胞中α3nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化。用1μmol/Lβ-淀粉样肽1-42（Aβ1-42）处理转染细胞后,用四甲基偶氮唑盐（MTT）方法测定细胞活力;用比色法测定其指质过氧化产物含量、超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性。结果：成功构建α3nAChR siRNA表达质粒,转染后经G418筛选获得稳定转染重组质粒的细胞克隆株,与对照组相比,α3nAChR mRNA及蛋白表达量均降低（抑制率分别为98%和66%）;经转染处理的细胞活力明显低于对照组,细胞中脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加,超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性不同程度的降低;抑制α3nAChR基因表达后能增强Aβ的神经细胞毒性作用。结论：成功构建的α3nAChR siRNA表达质粒能特异性抑制α3nAChR基因表达,α3nAChR基因表达抑制后可引起氧化应激水平升高,并增加Aβ的神经毒性,表明α3nAChR具有一定的抗氧化能力和神经保护作用。     

siRNA沉默PC3细胞中KDR基因的表达

目的:构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(KDR)基因的shRNA表达载体,研究KDR基因沉默后对PC3细胞的增殖、生长的影响.方法:将合成的三对DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencerTM3.1-H1 neo线性质粒用T4 DNA连接酶连接,构建pSilencer3.1-KDR1,psi-lencer3.1-KDR2和Psilencer3.1-KDR3三个siRNA表达载体.经酶切及DNA测序鉴定后,采用脂质体介导的基因法转染PC3细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验,检测KDR的表达变化,MTT法检测细胞牛长速度的变化,流式细胞仪检测细胞周期的变化,以未转染和转染阴性对照质粒pSileneer3.1-NC的PC3细胞为对照.结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验表明,pSilencer3.1-KDR3有效地降解了PC3细胞中KDR基因的mRNA,下调蛋白表达;转染pSilenc-er3.1-KDR3后PC3细胞生长速度明显变慢.结果表明,pSi-leneer3.1-KDR3组PC3细胞的G0/G1期百分率明显增高,而S期和G2M期的细胞减少,与其余组相比差异具有统计学意义(P<0.01).而pSilencer3.1-KDR1和pSilencer3.1-KDR2无效.结论:成功构建针对KDR基因的siRNA表达载体,只有pSileneer3.1-KDR3可有效地沉默KDR在前列腺癌细胞系PC3细胞中的表达,抑制PC3细胞的增殖.     

SiRNA真核表达载体阻断HeLa细胞stathmin基因表达研究

目的：构建人stathmin基困的siRNA真核表达载体,探讨其对HeLa细胞中stathmin基因表达的干涉作用．方法：将合成的siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4．1-CMV neo真核表达载体,酶切及测序鉴定．脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选后RT—PCR检测其对stathmin基因mRNA的干涉效果．结果：经酶切及测序鉴定,成功构建siRNA真核表达载体＋经脂质体转染HeLa细胞后,RT—PCR显示所构建的干涉stathmin基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达,HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低．结论：成功构建了人stathmin基因的RNA干涉真核表达载体pSilencer—S1和pSilencer—S2,并在HeLa细胞中有效地发挥了对stathmin基因表达的干涉作用．     

靶向mdr1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒.方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM 3.1-H1 neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体.采用酶切法和测序法鉴定.结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66 bp模板寡核苷酸片段和4.3 kbp的线性化的pSilencerTM 3.1-H1 neo载体片段.重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符.结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础.     

KDR siRNA表达载体的构建和鉴定

目的: 构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(VEGFR2),又称激酶功能区受体(KDR)的pSilencerTM3.1 siRNA(small interfering RNA)表达载体,并在前列腺癌细胞PC3中观察其干扰效果. 方法: 设计针对KDR基因编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经BamH Ⅰ, HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1-H1 neo中,对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定. 以脂质体法将pSilencerTM3.1-H1 neo空载体和3个(pSilencer3.1-KDR1, pSilencer3.1-KDR2和pSilencer3.1-KDR3)重组质粒分别导人PC3前列腺癌细胞系. 72 h后用RT-PCR和Western blotting技术检测各实验组前列腺癌细胞内KDR mRNA及蛋白水平的表达情况. 结果: 经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片断. 转染KDR-siRNA的前列腺癌细胞,72 h后,而以pSilencer3.1-KDR3的抑制KDR mRNA及蛋白表达效果最为有效,其抑制率约为55%. 结论: 成功构建了针对KDR的RNA干扰表达载体pSilencer3.1-KDR1, pSilencer3.1-KDR2和pSilencer3.1-KDR3, pSilencer3.1-KDR3能有效抑制KDR在前列腺癌细胞中表达,为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.     

Survivin基因siRNA表达载体的构建及其在食管癌EC109细胞中的表达

目的 为研究survivin基因的功能及食管癌的基因治疗，构建针对survivin基因的siRNA的表达载体，转染细胞EC109后观察其对survivin基因表达的抑制作用。方法 利用网站选择适当位点设计并合成针对survivin基因mRNA的寡核苷酸序列，插入质粒pBAsi-hU6中形成重组载体pBAsi-survivin。重组载体经测序鉴定后转染食管癌细胞EC109，western blot检测转柒前后survivin蛋白的表达情况。结果 测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致，证实成功构建了针对survivin基因的siRNA表达载体。Western blot检测显示转染食管癌细胞EC109后有效抑制了survivin基因的表达。结论 针对surivivin基因的siRNA表达载体成功构建，并能有效抑制食管癌细胞EC109中survivin基因的表达。     

针对DEK原癌基因的siRNA真核表达载体的构建

目的 以DEK基因为靶基因,针对其特定核苷酸序列,构建psiRNA-hHDEK表达载体,转染宫颈癌CaSki细胞,观察DEK siRNA对DEK基因mRNA转录水平和蛋白表达水平的靶向沉默效应.方法 根据DEK核苷酸序列,利用软件设计出针对DEK位点的特异性小干扰RNA,克隆至siRNA真核表达载体psiR-NA-hHlneo中,构建能在真核细胞中表达的靶向DEK基因的siRNA重组质粒;应用脂质体介导重组质粒转染宫颈癌CaSki细胞株,用RT-PCR和Western Blot检测转染后DEK mRNA和蛋白表达.结果 筛选出阳性克隆,抽提质粒,经限制性内切酶AseI酶切鉴定及测序分析证实合成的siRNA序列正确,并已准确克隆入psiRNA-hHl neo我体中.DEK特异性siRNA栽体构建成功.经RT-PCK和Western Blot测定分析,转染质粒psiRNA-hHDEK CaSki细胞组DEK mRNA和蛋白的表达明显减少.结论 成功构建了DEK特异性siRNA表达载体.设计构建的真核表达载体可以特异性干扰DEK原癌基因的表达,为进一步研究DEK基因的功能奠定了基础.     

人CXC型趋化因子受体CXCR6真核表达载体的构建及生物学功能研究

目的:克隆和构建带人CXC型趋化因子受体6(CXCR6)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+).CXCR6,分析瞬时转染CXCR6基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响.方法:Trizol一步法抽提人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR扩增CXCR6全长基因,克隆入T载体,测序,双酶切连入真核表达载体peDNA3.1(+),酶切鉴定.将构建好的pcDNA3.1(+)-CXCR6瞬时转染.MDA-MB-231细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达.利用微孔隔离小室检测转入人CXCR6基因的MDA-MB-231细胞的迁移能力.结果:扩增出人CXCR6基因全长,测序结果和GenBank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+).瞬时转染pcDNA3.1(+)-CXCR6显著增强MDA.MB-23l细胞的迁移能力.结论:成功构建带有人CXCR6基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CXCR6,为CXCR6在肿瘤学中的研究奠定基础.     

小干扰RNA对Jurkat细胞CXCR4基因表达的影响

目的 研究小干扰PNA(siRNA)对Iurkat细胞趋化因子受体4(CXCR4)基因表达的影响.方法 用针对CXCR4基因的siRNA转染人急性T细胞性白血病细胞系Iurkat细胞,用RT-PcR方法 检测其CXCR4基因表达水平的变化.结果 CXCK 4siPNA转染Iurkat细胞48 h后,其表达水平下降,能明显抑制CXCR4基因的表达.与空白对照组和阴性对照组比较,其差异有统计学意义(P＜0.01).结论 利用RNA干扰技术能有效抑制靶基因的表达,为下一步有关Iurkat细胞CXCR4基因的研究奠定一定的基础.     

核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

载体介导的RNA干扰技术对甲状腺癌细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制作用

目的应用载体介导的RNA干扰(RNA i)技术特异性地抑制甲状腺癌细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达。方法构建利用U6启动子转录功能性小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后,转染人甲状腺癌FRO细胞,利用RT-PCR和W eston blot法检测hTERT基因的表达情况。结果构建的表达质粒转染FRO细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平明显降低,抑制率分别为76%和81%。结论siRNA的表达质粒能成功抑制甲状腺癌细胞hTERT基因的表达,为RNA i技术应用于甲状腺癌的基因治疗提供了实验基础。     

Fas基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建肿瘤凋亡基因Fas小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肺腺癌A549细胞Fas基因表达的阻抑作用,探索Fas/FasL途径在肺癌转移中的作用机制。方法设计有小发夹结构的3条Fas siRNA对应模板DNA序列,退火处理后克隆至pGCsi-U6质粒,构建重组质粒pSi-Fas。将pSi-Fas转染人肺癌A549细胞,采用Western blot检测Fas表达。结果酶切及测序证实质粒pSi-Fas构建成功,可显著抑制A549细胞Fas蛋白表达。结论成功构建的Fas siRNA表达质粒pSi-Fas能抑制人肺癌A549细胞Fas蛋白表达。     

RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉默对肺癌细胞定植和转移的影响

目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,观察RNA干扰介导的MAGE3基因表达默寂对肺癌细胞定植和转移的影响.方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneoGFP载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人肺癌细胞NCI-H446,采用RT-PCR和Western印迹检测MAGE3基因mRNA和蛋白表达水平的变化.用软琼脂克隆形成实验和细胞体外侵袭实验,观察对肿瘤形成能力和侵袭力的影响.结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPERneoGFP载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western印迹检测显示, MAGE3基因的表达水平明显降低;转染siRNA表达载体组的肺癌细胞在软琼脂中形成克隆数和穿透Matrigel的细胞数都显著下降,与未转染和转染空载体组比较差异有显著性（P﹤0.05）.结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体, RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉寂可有效降低肺癌细胞定植和转移.     

PTTG靶向siRNA表达载体构建及其沉默效率评价

目的：构建针对人脑胶质瘤细胞系U251的高效率沉默垂体瘤转化基因(PTTG)的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体。 方法：合成特异性干扰PTTG 的siRNA片段,并与pGenesil2 载体连接,构建PTTG干扰载体（pGenesil2-PTTG siRNA）。利用脂质体将其转染U251细胞,分为正常细胞对照组、HK阴性对照组和3个siRNA干扰组（pGenesil2-PTTG siRNA1、pGenesil2-PTTG siRNA2和pGenesil2-PTTG siRNA3）,应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法和流式细胞术对转染后U251细胞中PTTG 的mRNA和蛋白表达水平进行分析。 结果：酶切证实PTTG-siRNA表达载体构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;转染pGenesil2-PTTG siRNA后,3个干扰组的U251 细胞中PTTG基因和蛋白表达水平均较正常对照组显著降低（P<0.01）。 结论：成功构建了能高效率沉默PTTG 的RNAi表达载体;pGenesil2-PTTG siRNA高效地抑制了胶质瘤U251细胞中PTTG基因的表达。     

容量调控氯通道基因siRNA表达载体的构建及其沉寂效应检测

目的:构建针对容量调控氯通道基因(CLC3)的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对CLC3基因的干扰作用. 方法:设计CLC3靶向的发夹状siRNA,据此设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPER载体,转化扩增后进行序列测定. 用脂质体转染法转染胃癌细胞SGC7901,通过RT-PCR、间接免疫荧光检测CLC3基因表达水平的变化. 结果:把针对CLC3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pSUPER载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确,稳定转染人胃癌细胞SGC7901后, RT-PCR、间接免疫荧光检测表明,CLC3基因的表达水平明显降低. 结论:构建了针对CLC3基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制CLC3基因表达.     

HCMV-IE1基因siRNA真核载体的构建及其效率研究

目的 采用RNA干扰技术研究在体外对人巨细胞病毒即刻早期Ⅰ基因(HCMV-IE1)表达的沉默作用.方法 根据HCMV-IE1基因表达框,设计siRNA干扰序列,重组至带U6启动子真核表达载体,构建针对HCMV-IE1基因的siRNA真核表达载体(pHCMV-IE1i);经测序鉴定后,脂质体法转染HEL细胞HCMVAD169株,应用荧光显微技术、流式细胞术和RT-PCR法检测分析pHCMV-IE1i对HCMV-IE1基因的表达干扰效果.结果 测序结果显示针对HCMV-IE1基因的pHCMV-IE1i构建成功;荧光显微结果表明pHCMV-IE1i转入HEL细胞后可以特异抑制细胞中HCMV-IE1基因的表达;流式细胞术结果显示对照细胞组HCMV-IE1基因表达阳性率达60%以上,干扰细胞组HCMV-IE1基因表达阳性率仅达10%左右(P＜0.05);RT-PCR检测结果发现pHCMV-IE1i能显著抑制HCMV-IE1基因的表达(P＜0.05).结论 采用RNAi技术能有效抑制HCMV-IE1基因在细胞内的表达,对探讨其在防治HCMV感染疾病中的作用与意义提供了科学的实验依据.     

低表达Cbfa1基因的人牙周膜细胞模型的建立及鉴定

目的:构建针对核心结合因子a1(Cbfa1)的mU6小干扰RNA载体,并将其转染到人牙周膜细胞hPDLCs,观察其干扰效果,以期建立稳定的低表达Cbfa1基因的hPDLCs模型. 方法:设计针对Cbfa1基因编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经双酶切线性化的小干扰载体mU6中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定. 以脂质体法将mU6空载体和重组质粒分别导人hPDLCs细胞系. 用含G418的培养液筛选,挑取阳性克隆后用RT-PCR技术检测各hPDLCs克隆内Cbfa1 mRNA水平的表达情况. 结果:经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒Cbfa1-siRNA中插入的目的基因片段与预计片段完全一致. G418筛选转染细胞4wk后获得稳定转染mU6空载体的细胞克隆株hPDLCs-mU6和稳定转染重组质粒的细胞克隆株hPDLCs-siRNA. 经RT-PCR鉴定,Cbfa1在hPDLCs-siRNA细胞中的表达比对照细胞明显降低. 结论:成功构建了针对Cbfa1的小干扰RNA载体,成功建立了稳定的低表达Cbfa1的hPDLCs模型,为进一步研究Cbfa1的功能奠定了实验基础.     

稳定沉默CXCR4表达的肾癌A498细胞株的构建

目的应用RNA干扰技术降低肾癌A498细胞株的CXCR4基因表达水平,并建立稳定转染细胞株。方法针对CXCR4基因设计合成siRNA,转染肾癌A498细胞株,采用RT-PCR法检测CXCR4基因表达变化,根据有效干扰片段结果合成重组shRNA质粒,稳定转染至A498细胞系并进行G418抗性筛选细胞株。采用RT-PCR和Westen印迹法检测CXCR4mRNA及蛋白表达水平,应用流式细胞技术检测CXCR4shRNA诱导A498细胞凋亡的效应,Transwell试验检测细胞侵袭能力的改变。结果将CXCR4重组shRNA质粒成功转染A498细胞后,肾癌细胞内可见绿色荧光,通过G418筛选,获得了CXCR4基因沉默的A498细胞系,RT-PCR及Western印迹检测证实该细胞系的CXCR4水平明显低于对照组的表达水平(P<0.05)。CXCR4shRNA组细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均显著高于对照组(P<0.05),Tran-swell体外侵袭实验显示CXCR4shRNA能明显抑制A498细胞的体外侵袭力(P<0.05)。结论成功构建稳定沉默CXCR4表达的肾癌A498细胞株,转染后的细胞凋亡率升高,体外侵袭能力降低,为后续研究奠定了基础。