经外路途径行异种视网膜片移植的实验研究

目的：探讨经外路途径行视网膜下腔的全层异种视网膜移植的方法，并对移植结果进行初步观察。方法：用明胶包埋小鼠视网膜制成视网膜移植片，九只兔按外路手术方法将植片植入视网膜下腔。移植术后1-23天摘除动物眼球，石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜观察。结果：明胶包埋的视网膜移植片可以被植入宿主视网膜下腔中，视网膜移植片平铺于宿主视网膜下腔中，植片外层与宿主视网膜色素上皮层相贴、存活，未见明显免疫排异反应。结论：视网膜下腔是较为理想的视网膜移植的受位；明胶包埋的异种视网膜植片可作为供体进行移植；移到视网膜下腔的异种视网膜能够存活，这一结果为今后异种视网膜移植研究奠定了基础。     

兔视网膜色素上皮细胞移植的实验研究

目的 用改良的二步酶法制备视网膜色素上皮（RPE）细胞悬液，不做玻璃体切割，直接进行视网膜下间隙的移植。方法 用酶I（含220kU/L)透明质酸酶和0.1%胰蛋白酶）分离视网膜神经上皮层与RPE之间的联系，再用酶Ⅱ（含0.25%胰蛋白酶）将RPE从玻璃膜上分离下来获得悬浮的RPE细胞，用特制的移植针头通过人为造成的局限性视网膜脱离区将其移植入受体视网膜下间隙。结果 术后2周供体RPE细胞呈单层排列于受体视网膜下间隙并存活，未见明显炎症反应。电镜观察术后5周供体RPE细胞位于受体Bruch膜上并与受体感光细胞外节盘膜形成镶嵌关系。结论 改良的内路法可以将供体RPE细胞成功移植在受体眼视网膜下间膜，并至少存活7周。     

光性视网膜变性猪视网膜移植术后视功能的综合评价

目的 通过移植分化完成而发育不完全的新生猪全层视网膜组织,探讨此种供体改善光变性猪视功能的可能性.方法 选1～6 d新生小猪为供体,用准分子激光微切削脉络膜制备神经上皮-RPE联合移植片,并通过玻璃体-视网膜手术将联合移植片移植进光变性猪视网膜下腔.在视网膜移植术后1周、1～5个月,通过检眼镜、眼底彩照、荧光造影,观察移植物的存活状况及宿主视网膜有无排斥反应迹象;用mfERG检测并比较不同时相间N1、P1波振幅和潜伏期,综合评价移植术后视网膜功能的变化.结果 对8只光变性猪15眼实施视网膜移植手术,移植物植入视网膜下腔11眼,手术成功率为84.6%.移植术后1～2个月可见与宿主视网膜有清楚界限的移植床及其内灰黑色移植物, FFA检查可见移植物有荧光渗漏.光变性猪视网膜移植术后1～5个月, mfERG检测N1波、P1波幅值和潜伏期并在不同时相点间比较,发现N1波、P1波幅值随存活时间延长而增高,反应活跃区在第2、3环;而各环N1波、P1波潜伏期较手术前均明显缩短,存活后期更显著.结论 功能检测结合活体形态的同步观察,综合评价视网膜移植术后光变性猪视网膜功能改善的效果,从而证实了分化成熟的新生猪视网膜移植确实改善了光变性猪的视网膜功能.     

异体恒河猴视网膜色素上皮细胞移植探讨

目的 观察供体视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)在视网膜下腔生长情况,为视网膜色素上皮细胞移植的临床应用提供实验基础.方法 体外获取恒河猴视网膜色素上皮细胞经传代培养至第3代,用5-溴脱氧尿嘧啶标记后经外路将供体色素上皮细胞移植到受体恒河猴视网膜下腔,用光镜和电镜观察移植细胞的存活情况.结果 供体细胞在受体视网膜下腔形成有极性的单细胞层,贴附于Brueh膜上,并形成微绒毛和基底内褶,细胞内可见吞噬体.结论 外路法是一种切实可行的视网膜色素上皮移植方法,移植后的细胞可存活并恢复正常的结构和功能.     

胎兔视网膜色素上皮移植的初步研究

目的:观察受体Bruch膜和视网膜色素上皮(retrial pigment epithelial,RPE)受损情况下供体RPE细胞的增殖、分化和凋亡状况。方法:制备有色素胎兔RPE细胞悬液,移植至破坏了Bruch膜和RPE细胞的12只成年新西兰大白兔的视网膜下腔。左眼作为实验组,右眼作为对照,于术后3、7和14d, 采用Ki-67免疫组化和TUNEL染色,并提取RPE细胞DNA作琼脂糖凝胶电泳,观察Ki-67阳性RPE细胞及移植的RPE细胞和受体ONL细胞的凋亡百分率,行统计学分析。结果:术后随着时间的延长,实验组或对照组Ki-67阳性RPE细胞数显著增加(P<0.05);术后14 d实验组或对照组的TUNEL染色ONL核阳性百分率较术后3 d显著减少(P<0.05);术后实验组TUNEL染色阳性和细胞核深染的RPE细胞无显著增加(P>0.05);细胞核深染的RPE细胞百分率明显高于TUNEL阳性的细胞(P<0.01)。对照组未见TUNEL阳性的RPE细胞。术后14d,移植的RPE细胞DNA电泳出现典型的凋亡带。结论:在受体Bruch 膜、RPE受损状态下,供体的RPE细胞具有良好的增殖和分化能力。     

不同日龄视网膜变性大鼠眼底组织结构学观察

目的 探究转基因视网膜退行性变性S334ter-line-3大鼠在出生后不同日龄视网膜组织结构学变化.方法 选择出生后1,9,11,18,30,59 d的S334ter-line-3大鼠,断颈或腹腔注射过量麻药后处死大鼠,摘除双眼球,置入眼球混合固定液及福尔马林液中,左眼行常规石腊包埋,右眼行Histocryl plastic包埋,HE染色,光学显微镜下观察不同时点视网膜组织学结构.结果 出生后第1天,S334ter-line-3大鼠视网膜是一种未发育完善的胚胎型组织,仅有RPE细胞层、祖细胞层,短的内丛状层和神经节细胞层;第9天时其视网膜发育才较完善.第11天时视网膜感光细胞层即开始发生退行性变性,其外核层内可见深染皱缩的凋亡细胞核;第18天时感光细胞层内外节几乎完全消失,外核层变薄,胞核数仅为正常1/2;第30天时,S334ter-line-3大鼠视网膜外层退行性变性已基本完成,仅残留1排感光细胞核层,其外接RPE细胞层,内接视网膜内核层;第59天视网膜结构与第30天基本相同.结论 S334ter-line-3大鼠在出生后随年龄的增长,视网膜外层逐渐发生退行性变性,至出生后第30 d时这种退行性变性基本完成,故出生后30 d的大鼠适合作为视网膜移植中的移植受体.     

腺病毒介导神经生长因子对遗传性视网膜变性RCS大鼠视细胞的营救

目的 :探讨先天性视网膜变性病因以及对其进行基因治疗的可行性。方法 :TUNEL法对RCS大鼠视细胞的丧失进行研究 ;构建分泌表达型重组腺病毒穿梭质粒 pAdE1CMV NGF ,经与 pJM17在 2 93细胞中同源重组 ,获得复制缺陷型重组腺病毒AdE1CMV NGF。琼脂糖覆盖法测定滴度。AdE1CMV NGF和AdE1CMV LacZ转导培养视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞。将AdE1CMV LacZ转导组进行x gal染色估计转导效率 ,取AdE1CMV NGF转导组RPE细胞及其条件培养液 ,用RT PCR和WesternBlot进行表达检测 ,用条件培养液刺激PC12细胞 ,证实表达活性。直接进行RCS大鼠视网膜下腔转导 ,一眼注射AdE1CMV NGF ,则另一眼注射AdE1CMV LacZ ,左右眼随机进行。光镜下观察视细胞存活情况。结果 :TUNEL法显示 2 5、35、45、5 5及 6 5dRCS大鼠视网膜视细胞层存在广泛凋亡 ;AdE1CMV NGF的滴度可达 5× 10 10 pfu/ml;4.6× 10 6pfu/ml滴度AdE1CMV LacZ可使RPE细胞发生 10 0 %转导 ;PC12细胞受AdE1CMV NGF转导RPE细胞条件培养液刺激长出突触 ;AdE1CMV NGF视网膜下腔注射使RCS鼠视细胞存活时间明显延长 ,达 15d以上。结论 :视网膜变性模型RCS大鼠视细胞的丧失是以凋亡方式进行 ,腺病毒介导神经生长因子可延长其存活时间     

移植视网膜组织视蛋白的测定（摘要）

目的 :建立玻璃体内视网膜移植的动物模型 ,检测玻璃体内视网膜移植片视蛋白的表达 ,确定移植后视网膜的功能 .方法 :取 1～ 5d新生兔 12只 ,取出神经视网膜组织 ,作为供体 .取成年兔 12只 ,经角巩膜缘切口 ,囊内去除晶状体 ,切除前段玻璃体后 ,将供体兔右眼视网膜移植到成年兔右眼的玻璃体腔 ,分别于手术后 7,14,2 1d取出供体视网膜组织 ,抽提视网膜的总蛋白 ,用SDS -PAGE分离蛋白质 ,WesternBlot进行视蛋白的鉴定 .结果 :( 1)移植到玻璃体腔后 ,受体眼早期有一定反应 ,经过用药后消失 ;( 2 )移植后的视网膜可以成活 ;( 3 )在移植后 7,…     

移植视网膜组织视蛋白的测定

目的:建立玻璃体内视网膜移植的动物模型,检测玻璃体内视网膜移植片视蛋白的表达,确定移植后视网膜的功能.方法:取1～5 d新生兔12只,取出神经视网膜组织,作为供体.取成年兔12只,经角巩膜缘切口,囊内去除晶状体,切除前段玻璃体后,将供体兔右眼视网膜移植到成年兔右眼的玻璃体腔,分别于手术后7,14,21 d取出供体视网膜组织,抽提视网膜的总蛋白,用SDS-PAGE分离蛋白质,Western Blot进行视蛋白的鉴定.结果:(1)移植到玻璃体腔后,受体眼早期有一定反应,经过用药后消失;(2)移植后的视网膜可以成活;(3)在移植后7,14,21 d的视网膜移植片中检测到视蛋白存在.结论:(1)我们建立的玻璃体腔内视网膜移植的动物模型具有可行性;(2)移植到玻璃体腔内的视网膜组织可见到视蛋白的继续表达;(3)通过对玻璃体内视网膜移植的实验研究,为进行原位视网膜移植打下了一定基础.     

Long Evans和Wistar大鼠视网膜神经节细胞电生理学及形态学特性比较研究

目的比较Long Evans大鼠和Wistar大鼠睁眼前后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)电生理学特性及形态学特征上的差异.方法取出生后0～31 d Long Evans和Wistar大鼠,各按睁眼时间分为两组,制备视网膜片,行膜片钳全细胞记录,同时行组织切片和细胞内染色,观察形态特征.结果比较22只Long Evans大鼠和24只Wistar大鼠被动膜学特性和动作电位(action potential, AP)幅度及阈值无显著差异,形态学上除两者视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)含或不含色素颗粒外未见明显区别.结论 Long Evans大鼠因其RPE含色素颗粒,以及在视觉和神经系统等方面的优点,可取代Wistar等白化鼠而作为一种良好的视觉和神经科学研究的实验动物模型.     

嗅鞘细胞移植后通过分泌MMP-3在RCS-P~+大鼠视网膜中迁移

目的初步研究将嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)及嗅球成纤维细胞(olfactory nerve fibroblasts,ONF)混合细胞移植到皇家外科学院大鼠(Royal College of Surgeon rat,RCS-P+rat)的视网膜下腔后,OECs/ONF迁移进入视网膜的机制。方法离体实验中,取成年RCS-rdy+-P+大鼠的嗅球培养OECs/ONF至14 d行OECs/ONF的基质金属蛋白酶-3(matrix-metalloproteinase-3,MMP-3)细胞免疫荧光染色。收集5、8、11、14 d OECs/ONF培养液上清,与普通培养液超滤后进行酶联免疫吸附实验(ELISA),检测MMP-3的含量变化。在体实验中,制作40只RCS-P+大鼠单眼视网膜下腔细胞移植,并以对侧眼作为伪手术组以及相同天龄未处理大鼠作为对照组。术后7、14、21、28 d用ELISA法检测细胞移植组、伪手术组及未处理组大鼠视网膜中MMP-3含量的变化。将携带绿色荧光的慢病毒感染后的OECs/ONF移植到4只RCS-P+大鼠视网膜下腔,激光共聚焦显微镜观察移植后7、14、21 d及28 d OECs/ONF在视网膜中迁移情况。结果离体实验中,培养14 d时OECs/ONF的MMP-3免疫细胞化学染色阳性。OECs/ONF培养液上清MMP-3含量分别为5 d(2.83±0.80)、8 d(6.34±1.12)、11 d(11.65±1.35)、14 d(19.11±2.11),明显高于普通D/F12+10%FBS培养液(1.65±0.44)(P<0.01);在体实验中,移植后21 d及28 d,OECs/ONF移植组视网膜MMP-3的含量[(1.80±0.29)、(3.96±0.51)]明显高于伪手术组[(1.17±0.20)、(1.83±0.26)]和未处理组[(1.19±0.17)、(1.92±0.25)](P<0.01),伪手术组与未处理组之间无明显统计学差异(P>0.05)。激光共聚焦显微镜观察可见移植后7～28 d,OECs/ONF在视网膜中迁移,最远能够达到神经节细胞层。结论 OECs/ONF移植到RCS视网膜下腔后,可能通过分泌MMP-3在RCS-P+大鼠视网膜中迁移。     

活体染料标记原代IPEC眼内移植的研究

目的 探讨应用活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFDA-SE)标记原代的兔自体虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelial cell,IPEC),并移植于视网膜神经上皮层下的可行性.方法 取原代兔眼自体虹膜色素上皮细胞消化分离,经CFDA-SE染色后移植到视网膜神经上皮层下.术后不同时间应用彩色眼底照相、激光扫描检眼镜(SLO)、光学相干断层扫描(OCT)进行活体观察,不同时间点对移植眼进行切片并常规染色及免疫组化,用光学显微镜对移植细胞进行观察和评价.结果 自体移植术后观察显示移植区界限清晰;SLO可观察到移植区内荧光分布;OCT和HE染色均显示移植区神经上皮层下有移植物堆积,并随时间推移逐渐变平.免疫组化显示移植区ZO-1、Actin呈棕色点,有规律地间断分布在Bruch膜上,IPEC嵌插在原始的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell,RPEC)间,且形成完整的单层.结论 CFDA-SE作为活体染料标记自体IPEC进行移植时,是一种快捷、稳定、安全的活体细胞染料,可作为理想的标记物应用.     

猴眼视网膜下注射方法的建立

目的: 探索一种简便、有效的视网膜下注射方法. 方法: 利用自制玻璃微穿刺针系统,在猴视网膜黄斑区进行视网膜下药物注射. 猕猴30只(30眼),其中,15只眼在进行视网膜下药物注射的前1 d接受黄斑周围激光光凝. 结果: 30只眼中,29只眼的视网膜下注射为一次成功. 1只在预先的BSS注射时形成视网膜内界膜隆起,重复穿刺成功. 2只黄斑周围进行过激光光凝眼(2/15),发生黄斑中心凹破裂. 术中无严重的视网膜出血,未发生脉络膜损伤. 术后观察3～42 d,未发生孔源性视网膜脱离等并发症. 结论: 自制的玻璃微穿刺针视网膜下注射系统简单易行、成功率高、可控性好.     

微量全氟加萘对家兔视网膜毒性作用的剂量关联性

目的：通过视网膜的病理组织学检查,研究微量全氟加萘（PFD）对家兔视网膜的毒性作用的剂量关联性,为临床应用提供实验性参考依据。方法：将24只实验家兔的48只眼随机分为实验组36只眼、对照组12只眼,实验组再分为3组,每组12只眼,将30、50、100 μL的PFD及BSS液体分别直接注射到家兔视网膜表面。注射液体后每日用检眼镜观察家兔视网膜情况,在注射后第4、7、14、21天,分别对每个实验组及对照组做透射电镜的视网膜组织切片观察。结果：各组实验样本检眼镜检查在各个时间均正常,未发现视网膜有任何病理改变。透射电镜检查,注射液体后第4天,各个剂量组视网膜没有实质性损害,仅100μL组出现了早期变化,1例视网膜出现视细胞核周围间隙略增大,核略不规则,基质略致密;从第7天开始,各个剂量实验组视网膜均有相似的病理变化,相继出现光感受器外节、外丛状层的损害,光感受器变性,内核细胞囊泡形成,神经节细胞的损害,内层视网膜坏死,视网膜内吞噬细胞反应,视网膜色素上皮细胞吞噬膜盘,顶部微绒毛脱落;对照组视网膜未发现有任何病理改变。结论：微量PFD存在于眼内,视网膜毒性发展进程与PFD的残留剂量无关联;但大剂量残留的PFD可使视网膜毒性较早发生。     

兔出血性视网膜脱离的视觉电生理变化

目的 :观察在一种兔出血性视网膜脱离 (hemor rhagicretinaldetachment,HRD)模型中的视功能损害 .方法 :12只健康青紫蓝兔 ,设立HRD组 (视网膜下腔注入 0 .2mL自体血 ) ,视网膜脱离 (retinaldetachment,RD)组和假注射组 .于HRD建立前 2d ,建立后 3h ,1,3,7,14 ,2 1和 2 8d行视网膜电图 (electroretinogram ,ERG)和视觉诱发电位 (visualevokedpotential,VEP)检查 .结果 :HRD建立后ERGa及b波的潜伏期均延长 ,3～ 7d升至最高点 ,后有所恢复 ,但在 2 8d仍较正常水平延长约 5 % - 30 % .其振幅于 3d降到最低点 ,7d时略有回升 ,遂进入平台期 ,直至 2 8d约相当于术前的 5 0 %(P <0 .0 5 ) .RD组相应的各波潜伏期术后略有延长 ,1d后接近术前值 .振幅在术后 1d下降到最低点 ,与假注射组有显著差异 (P <0 .0 5 ) .假注射组术后 3hERGs略有改变 ,而后恢复至正常值 .HRD组VEP的潜伏期和振幅值术后较另 2组分别延长和降低 ,3d后无明显变化 .结论 :采用视觉电生理检查客观评价此模型的视网膜功能损害 ,证实HRD损伤是涉及视网膜多层的不可逆性损伤     

胚胎脊髓组织植入成年鼠损伤脊髓的形态学研究

利用胚胎脑组织移植术,观察胚胎大鼠脊髓组织在同种成年鼠损伤脊髓内存活、生长情况。结果表明,将孕 １３～１６ｄ 的胚胎大鼠脊髓组织移植入成年鼠脊髓 Ｔ１１ Ｌ１ 背外侧组织创伤后 ３～５ｄ 的腔隙内,胚胎脊髓组织能在宿主鼠脊髓内存活,并生长发育成为成熟鼠脊髓组织构筑。移植组织存活率为 ５０％ 。胚胎鼠脊髓移植组织的存活受宿主脊髓损伤程度、供体胚龄、移植时间和部位、移植组织营养及供血等因素的影响。     

大鼠诱导性多能干细胞向神经前体细胞诱导分化研究

目的探讨大鼠来源的诱导性多能干细胞(iPS细胞)向神经前体细胞(NPC)定向诱导分化的方法。方法在大鼠iPS细胞培养到悬浮类胚体阶段加入维甲酸(RA)诱导分化,对分化获得的细胞,分别通过免疫荧光染色和实时定量PCR方法检测NPC标志物、用BrdU免疫荧光染色检测其增殖能力、并通过大鼠视网膜下腔移植对其存活、整合情况及分化能力进行检测。结果经诱导分化获得的细胞能够在贴壁培养条件下形成Rosette结构、表达NPC标志物并且绝大多数呈BrdU阳性,移植到大鼠视网膜下腔后能分化为神经元和胶质细胞。结论大鼠iPS细胞能够通过悬浮EB加RA诱导的方法分化为NPC,有可能作为细胞移植治疗视网膜退行性疾病的供体细胞。     

In Vivo Confocal Microscopic Observation of Lamellar Corneal Transplantation in the Rabbit Using Xenogenic Acellular Corneal Scaffolds as a Substitute

Background:

The limiting factor to corneal transplantation is the availability of donors. Research has suggested that xenogenic acellular corneal scaffolds (XACS) may be a possible alternative to transplantation. This study aimed to investigate the viability of performing lamellar corneal transplantation (LCT) in rabbits using canine XACS.

Methods:

Fresh dog corneas were decellularized by serial digestion, and LCT was performed on rabbit eyes using xenogeneic decellularized corneal matrix. Cellular and morphological changes were observed by slit-lamp, light, and scanning electron microscopy at 7, 30 and 90 days postoperatively. Immunocytochemical staining for specific markers such as keratin 3, vimentin and MUC5AC, was used to identify cells in the graft.

Results:

Decellularized xenogenic corneal matrix remained transparent for about 1-month after LCT. The recipient cells were able to survive and proliferate into the grafts. Three months after transplantation, grafts had merged with host tissue, and graft epithelialization and vascularization had occurred. Corneal nerve fibers were able to grow into the graft in rabbits transplanted with XACS.

Conclusions:

Xenogenic acellular corneal scaffolds can maintain the transparency of corneal grafts about 1-month and permit growth of cells and nerve fibers, and is, therefore, a potential substitute or carrier for a replacement cornea.     

关节软骨缺损膜移植修复与自身修复的实验研究

目的：探讨关节软骨的自身修复能力和方式及骨膜移植对软骨缺损重建的作用，方法：新西兰兔45只，分为软骨全部切除组，部分软骨切除线，骨膜移植组，各组15只，手术后2，4，8周各组处死5只，采用大体观察，组织切片及电镜进行评估。结果：软骨全切组与部分全层软骨切除组均以类透明软骨修重缺损，骨膜移植组各期之表现均优于前两组，有显著性差异（P＜0＝05），现生软骨接近正常软骨结构，纤维蛋白粘合剂固定骨膜牢牢靠，结论：兔软骨缺损缺乏自身修复能力，外源性修复以类透明软骨为主，骨膜移植修复优于自身修复，再生软骨接近正常软骨结构，应用纤维蛋白粘合剂粘贴骨膜是一种有效，可行的方法。