外源性α晶状体蛋白作用于视网膜神经节细胞的定位研究

背景视神经损伤后无法有效再生，而近年研究发现，α晶状体蛋白能显著促进视网膜神经节细胞（RGCs）的存活及轴突有效再生，但其分子机制尚不清楚。目的研究外源性α晶状体蛋白与RGCs的结合部位。方法从2只2d龄LongEvans大鼠视网膜中分离并原代培养RGCs，应用thyl．1和cy3抗体荧光染色技术对培养的RGCs进行鉴别并在荧光显微镜下计数RGCs阳性率。对外源性的α晶状体蛋白生物素化后用直接显色法进行鉴定，并用胰岛素实验对其分子伴侣活性进行测定，明确α晶状体蛋白生物素化成功并具有分子伴侣活性后与原代培养的RGCs共孵育，再与荧光标记的亲和素进行反应，在激光共焦显微镜下观察外源性仪晶状体与RGCs的结合部位。结果原代培养的RGCs阳性率为94％；生物素化α晶状体蛋白直接显色法鉴定整体显色强，其A450值随生物素化的α晶状体蛋白的浓度下降而下降，提示α晶状体蛋白生物素化成功；生物素化α晶状体蛋白的分子伴侣活性明显，且生物素化前后活性无明显改变；生物素化α晶状体蛋白与RGCs共孵育及荧光染色后，激光共焦显微镜下与生物素化α晶状体蛋白共孵育的RGCs细胞膜和轴突均可见红色荧光，细胞质和细胞核未见荧光染色。对照组RGCs未见荧光染色。结论外源性的α晶状体蛋白特异性地结合在RGCs细胞膜上，提示外源性的α晶状体蛋白通过与RGCs细胞膜特异性结合而发挥相应的生物学功能，但其结合方式及作用机制需进一步研究。     

人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞超微结构观察方法的优化

背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞的正常超微结构是其执行正常生理功能的解剖基础,目前用透射电子显微镜(TEM)检测RPE细胞的超微结构时常用细胞沉淀法,但经过胰蛋白酶消化的细胞会破坏原有的细胞生长状态,无法真实地反映出体外培养的RPE细胞的超微结构. 目的 探索一种能够简单、真实地反映体外培养的入胚胎干细胞(hESC)来源的RPE细胞超微结构的方法. 方法 将hESC经自然分化法诱导为hESC来源的RPE(hESC-RPE)细胞,采用免疫荧光法检测hESC-RPE细胞特异性蛋白小眼畸形相关转录因子(MITF)和人类配对盒基因6(PAX6)的表达.将hESC-RPE细胞种植于Transwell小室上进行培养,待细胞形成细胞片后通过TEM进行超微结构的观察,并与细胞沉淀法制备的hESC-RPE细胞标本的超微结构和90日龄Long Evans大鼠体内RPE细胞的超微结构进行比较. 结果 hESC-RPE细胞MITF和PAX6表达阳性.TEM下可见大鼠体内RPE细胞正常的超微结构,包括顶端微绒毛、极性分布的RPE细胞色素颗粒和细胞核、细胞基底膜和细胞间紧密连接.细胞片法TEM下可见Transwell小室上细胞片中hESC-RPE细胞形成了类似于大鼠体内RPE细胞的超微结构,但细胞顶端微绒毛较短,而细胞沉淀法观察到hESC-RPE细胞的细胞质中散在分布的色素颗粒、非极性的细胞核和少量的微绒毛.结论 TEM观察细胞超微结构时细胞片法不经过细胞的消化过程,保留了hESC-RPE细胞的正常结构,能简单、真实地反映体外培养RPE细胞的超微结构.     

晶状体蛋白促大鼠视网膜神经节细胞存活和突起生长的体外研究

目的探讨晶状体内各主要可溶性晶状体蛋白对离体培养的大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存活和突起生长的作用,为视神经损伤后再生的研究提供新的思路。方法采用分子排阻凝胶色谱法分离纯化晶状体中各主要可溶性晶状体蛋白——α、β-H、β-L、γ晶状体蛋白,再通过SDS-PAGE电泳、肽质量指纹图谱方法鉴定其为目的蛋白质后,按组分别进行RGCs离体培养试验,观察RGCs的最长突起长度和存活细胞数。结果RGCs的最长突起长度6 d时达最大值,分别为:对照组(92.27±35.93)μm,α晶状体蛋白组(181.59±43.78)μm,β-H晶状体蛋白组(123.33±52.81)μm,β-L晶状体蛋白组(89.55±22.40)μm,γ晶状体蛋白组(86.01±39.15)μm。6 d时,各组RGCs存活细胞数分别为:对照组(9.80±3.25)个/视野,α晶状体蛋白组(13.00±4.25)个/视野,β-H晶状体蛋白组(11.33±6.28)个/视野,β-L晶状体蛋白组(8.10±1.83)个/视野,γ晶状体蛋白组(5.74±2.82)个/视野。α、β-H晶状体蛋白组RGCs的最长突起长度和存活细胞数明显高于对照组,α晶状体蛋白组作用更明显,β-L晶状体蛋白组与对照组比较,差异无统计学意义,γ晶状体蛋白组存活细胞数在6d时明显少于对照组。结论α晶状体蛋白有明显的促进体外培养的RGCs存活和突起生长的作用,是一种晶状体源性神经保护物质。β-H晶状体蛋白也有一定的促RGCs突起生长和保护存活的作用。γ晶状体蛋白有一定的抑制RGCs存活的作用。     

角膜移植病人的健康教育

据统计 ,我国因角膜病而致盲的病人达百万以上 ,角膜移植是角膜病盲人唯一有效的复明手段。而角膜移植手术的成功除了需要精湛的手术和精心的护理外 ,还需病人良好的自我保健。因此 ,对角膜移植病人及家属进行全程健康教育 ,对确保手术成功和促进病人顺利康复非常重要。现将我们的方法介绍如下。1　健康教育前的评估1.1　评估对象 :1998年 1月至 2 0 0 0年 12月入院的 2 0 2例需做角膜移植手术的病人。1.2　评估方法 :除了常规评估病人的病史、文化程度等外 ,我们设计了“角膜移植病人最关心的问题排序表”和“角膜移植病人健康教育前相关知…     

三种不同方法保存的兔角膜内皮细胞形态学观察

目的 通过观察兔角膜内皮细胞形态,了解不同保存方法和不同保存时期及时间点对角膜内皮细胞活性和密度的影响.方法 采用短期湿房4 ℃保存6 h、D-X角膜中期保存液4 ℃保存3 d、长期深低温保存3个月,取3组各自限定时间的保存角膜片进行检测,分别行角膜内皮细胞茜素红和台盼蓝活性染色、光学显微镜观察及图像分析.结果 长期深低温保存后的兔角膜内皮细胞活性率、细胞密度及六边形细胞率低于前两组,细胞面积高于前2组,均具有统计学差异.结论 正确掌握3种方法,维持角膜内皮细胞生物活性,虽然深低温保存方法对角膜内皮细胞活性和密度有一定影响,但其活性率在80%以上,仍在角膜移植手术可接受的范围内.     

RCS大鼠视网膜色素变性过程中视网膜形态学研究

目的研究遗传性视网膜色素变性大鼠(Royal College of Surgeons rat,RCS rat)在视网膜变性发展过程中视网膜形态学变化.方法 RCS-p (视网膜含色素的变性大鼠)按出生后视网膜变性的发展状况分为变性早期(RCS15 d)、中期(RCS 30 d)、晚期(RCS90 d)3个时相点,分别采用相应时期的RCS-rdy p (视网膜含色素的正常大鼠)作为对照组(control groups,C 15 d,C 30 d,C 90 d),每组5眼,取各组大鼠眼球进行视网膜切片,行HE染色,采用MIAS-1000图像分析系统在400倍光镜下测视网膜外节(OS)、外核层(ONL)以及内核层(INL)厚度.结果①视网膜感光细胞随着病变的发展逐渐变性死亡,晚期视网膜色素上皮层和感光细胞层结构紊乱,但光镜下观察内核层、神经节细胞层仍保持较正常的形态.②与对照组比较,RCS大鼠视网膜色素变性过程中感光细胞外节膜盘堆积,外核层变薄,内核层在变性中期增厚,早期及晚期变薄.结论①RCS大鼠病变发展过程中视网膜各层神经元形态改变的不一致性.②变性中期视网膜内核层较对照组增厚,可能与该时期内核层神经元缺乏前级神经元的信号输入致细胞突起反应性增生,产生视网膜形态重构(remodeling)有关.     

周郁鸿用膏方调治血液病经验

周郁鸿,浙江中医药大学教授、博士生导师,第五批全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师,国家中医临床研究基地血液病学术带头人。从事中西医结合血液病临床、科研和教学工作30余年,在再生障碍性贫血、白血病、造血干细胞移植等方面有较深的造诣,对血液病的中医药辅助、分阶段治疗等方面有较深的见解。     

ALDH1A1调控Notch1信号通路在MMSCs“干性”维持中的作用和机制研究

目的:研究乙酰脱氢酶家族成员A1(ALDH1A1)调控Notch1信号通路在多发性骨髓瘤干细胞(MMSCs)“干性”维持中的作用和机制。方法:选用人MMSCs CD138-B细胞和人正常干细胞QSG-7701,用Western blot法检测ALDH1A1在CD138-B细胞和QSG-7701细胞中的表达情况。将CD138-B细胞分为control组、ALDH1A1敲减组、Notch1通路抑制剂组,control组不作任何处理,ALDH1A1敲减组转染10μg ALDH1A1-shRNA重组慢病毒质粒,Notch1通路抑制剂组加入20μmol/L Notch1通路抑制剂GSI,培养48h,检测并比较三组ALDH1A1表达量、Notch1通路相关蛋白[Notch1、发状分裂相关增强子1(Hes1)]表达量、增殖率、凋亡率及“干性”相关基因[胚胎干细胞关键蛋白(NANOG)、八聚体结合转录因子4(OCT4)]表达量。结果:CD138-B细胞中ALDH1A1蛋白表达量较QSG-7701细胞明显增加(P<0.05);ALDH1A1敲减组ALDH1A1蛋白表达量较control组明显减少(P<0.05);Notch1通路抑制剂组ALDH1A1蛋白表达量与control组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。ALDH1A1敲减组和Notch1通路抑制剂组增殖率及Notch1、Hes1蛋白和NANOG、OCT4基因表达量较control组明显减少(P<0.05),凋亡率较control组明显增多(P<0.05);Notch1通路抑制剂组增殖率、凋亡率及Notch1、Hes1蛋白和NANOG、OCT4基因表达量与ALDH1A1敲减组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:ALDH1A1在MMSCs中呈高表达,ALDH1A1敲减后可通过阻抑Notch1信号通路下调MMSCs“干性”维持,抑制MMSCs增殖并诱导其凋亡。     

医用组织黏合剂黏合兔眼巩膜穿通伤口与传统缝合的对比实验研究

目的 探讨a-氰基丙烯酸正辛酯为主体的医用化学组织黏合剂密闭兔眼巩膜全层裂伤的可能性.方法 45只成年兔建立经巩膜穿通伤模型,右眼用医用胶黏合,左眼缝线缝合,术后3、7、14、30、90天观察医用胶的降解,对比观察伤口组织病理学愈合情况.结果 医用胶能够迅速密闭巩膜伤口.术后各观察时间点,眼前、后节均未观察到炎症反应.电镜和光镜观察组织伤口均愈合.随巩膜伤口愈合,抗球内压力逐渐增加.医用化学组织黏合剂术后3个月分解吸收.结论 医用化学组织黏合剂可有效密闭巩膜穿通伤.