人胰岛淀粉样多肽沉淀细胞模型的体外构建

目的 构建人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)基因真核表达载体,并在无内源性IAPP表达的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株上进行体外表达实验,建立可产生hIAPP沉淀的细胞模型. 方法 应用RT-PCR技术扩增得到hIAPP cDNA,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-IAPP; 随后用lipofectamine 2000介导转染CHO细胞,以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达,以Thiaflavin S染色的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达. 结果 构建的pcDNA 3.1-hIAPP真核表达体系成功转染体外培养的CHO细胞,目的基因在mRNA 水平和蛋白水平均有表达,转染后培养48 h内的CHO细胞用Thioflavin S染色,与阴性对照相比较,证实有hIAPP的表达而导致细胞内淀粉样沉积发生. 结论 构建了hIAPP真核表达质粒, 并成功在体外表达, 从而建立了可产生IAPP淀粉样沉淀的体外哺乳动物细胞模型,为进一步研究胰岛淀粉样沉积的发病机制提供了良好的平台.     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.     

健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G（apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3G,APOBEC3G）基因cDNA,构建APOBEC3G基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。     

携带人alpha-突触核蛋白真核重组质粒构建及其SK-N-SH细胞表达

目的构建携带人alpha-突触核蛋白真核重组质粒,检测其在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中的表达及对细胞存活率的影响。方法 PCR扩增alpha-突触核蛋白基因,产物纯化后与pcDNA3.1(+)载体进行连接反应,构建pcDNA3.1(+)/alpha-突触核蛋白真核重组质粒。Lipofectamine法转染人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞,RT-PCR方法检测SK-N-SH细胞中alpha-突触核蛋白mRNA的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对细胞存活率的影响。结果酶切鉴定及基因测序证明人alpha-突触核蛋白基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)载体中。RT-PCR结果显示该表达载体转染SK-N-SH细胞后,细胞内alpha-突触核蛋白mRNA的表达水平明显增高,MTT方法检测结果显示该表达载体转染并未引起细胞存活率的改变。结论 alpha-突触核蛋白真核重组质粒构建成功,并可在SK-N-SH细胞内表达,且对细胞的存活率不产生任何影响,从而为进一步研究alpha-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的作用奠定了基础。     

多聚组氨酸标签的Attacin抗菌肽基因克隆及其在CHO细胞中稳定表达

目的 克隆家蝇幼虫抗菌肽Attacin-His_6融合基因,构建真核表达载体并转染CHO细胞表达,为深入研究其生物学活性创造条件.方法 以pUCm-T/Attacin载体为模板,用含6×His标签序列的下游引物克隆Attacin-His_6融合基因,并将其构建于pcDNA3.1( )中,pcDNA3.1/Attacin-His_6重组质粒转染CHO细胞,Zeocin G418筛选阳性细胞株,RT-PCR检测重组质粒在CHO细胞的转录情况.结果 成功扩增出Attacin-His_6融合基因,构建了pcDNA3.1/Attacin-His_6重组质粒并转染入CHO细胞中,RT-PCR从阳性克隆的CHO细胞中扩增出预期大小的目的 片段,从转录水平证实CHO-Attacin-His_6重组细胞株表达了Attacin-His_6基因.结论 抗菌肽Attacin基因哺乳动物型工程细胞表达系统的建立,为进一步制备其肽类抗生素奠定了基础.     

pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒的构建及其在人神经胶质瘤U251细胞中的稳定过表达

目的建立稳定过表达pcDNA3.1/连接蛋白43(Cx43)重组质粒的人神经胶质瘤U251细胞系。方法设计人Cx43的引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从低表达Cx43的U251细胞中扩增出目的片段,双酶切后定向连入pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒,经酶切、PCR、测序检测构建的正确性。采用脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,G418筛选出稳定转染的细胞系,采用RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染pcDNA3.1/Cx43重组质粒的U251细胞中Cx43基因、蛋白的表达水平。结果酶切、PCR及测序表明pcDNA3.1/Cx43重组质粒构建成功,筛选获得稳定过表达Cx43的U251细胞。结论构建了pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒及稳定过表达Cx43的U251细胞株,为下一步以Cx43为靶标进行人神经胶质瘤的基因治疗研究奠定了实验基础。     

重组人半乳糖苷结合凝集素-9质粒的构建及表达

目的构建人半乳糖苷结合凝集素-9(Galectin-9)的真核表达质粒pGalectin-9,并检测其表达。方法通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Galectin-9基因,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGalectin-9瞬时转染中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法检测Galectin-9的表达。结果 DNA测序和酶切鉴定证明Galectin-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGalectin-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法,在分子和细胞水平证实Galectin-9的表达。结论成功构建pGa-lectin-9的重组质粒,并证实其在CHO细胞中可以成功表达。     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

锌α2糖蛋白真核表达载体的构建和体外表达鉴定

目的 构建小鼠锌α2糖蛋白(mZAG)真核表达载体,在体外培养细胞中鉴定其mRNA和蛋白水平表达.方法 提取小鼠肝组织总RNA,采用RT-PCR法扩增mZAG全基因表达序列,酶切法将mZAG cDNA全序列插入表达质粒载体pcDNA3.1(-)中构建pcDNA3.1(-)-mZAG真核表达质粒.采用阳离子脂质体转染法将不同浓度mZAG表达质粒(0、0.4、0.8、1.6ug)pcDNA3.1(-)-mZAG和4对mZAG小干扰RNA(siRNA)序列转染到3T3-Ll前脂肪细胞中,实时荧光定量RT-PCR测定mZAG mRNA表达水平,Western blot检测mZAG蛋白表达情况.结果 测序鉴定证实成功构建mZAG真核表达质粒pcDNA3.1(-)-mZAG.实时荧光定量RT-PCR检测结果显示,0.4、0.8、1.6μg mZAG转染组3T3-Ll细胞中的mZAGmRNA表达水平分别是0μg mZAG转染组的2.58(P=0.002)、3.67(P=0.000)、5.19倍(P=0.001);mZAG-siRNA1组和mZAG-siRNA4组小鼠3T3-L1细胞中的mZAG mRNA表达水平显著减少,分别是不转染mZAG siRNA干扰序列对照组的49%(P=0.002)和41%(P=0.000).Western blot检测结果显示,0.8μg mZAG质粒转染组的体外mZAG蛋白表达水平是不转染mZAG质粒对照组的2.75倍(P=0.017);mZAG-siRNA1和mZAG-siRNA4干扰序列转染组的体外mZAG蛋白表达水平仅为对照组的55%(P=0.004)和62%(P=0.025).结论 成功构建mZAG真核表达载体,该载体能够在体外细胞中良好表达.筛选出能够显著抑制mZAG表达的siRNA1和siRNA4,为今后进一步深入研究ZAG提供了有用工具.     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2真核表达载体的构建及在SHG-44细胞的表达

目的：为探讨O-糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用和功能，构建pcDNA3／ppGalNAc-T2真核表达质粒并转染人神经胶质瘤细胞SHG-44。方法：采用PCR技术从pDONR201-T2得到ppGalNAc—T2全长编码序列，亚克隆至真核表达载体pcDNA-3．1，脂质体介导基因转染人神经胶质瘤细胞SHG-44细胞，采用RT—PCR法检测重组质粒的表达。结果：酶切图谱分析和基因测序证实pcDNA3．1-T2真核表达质粒构建成功。RT-PCR显示转染细胞有12的表达。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1-T2，并成功转染入SHG-44细胞，为进一步研究ppGalNAcT2的功能奠定了基础。     

cdx2真核表达质粒的构建

目的：构建含有cdx2全长基因的真核表达质粒并在人胃上皮细胞系中表达。方法：从人结肠上皮组织中提取总RNA,RT-PCR获得全长人cdx2基因的cDNA,测序证实序列正确后亚克隆入pcDNA3.1来构建重组真核表达载体pcDNA3.1/cdx2。使用脂质体将该重组质粒转染入人胃上皮细胞GES-1中,RT-PCR证明该细胞中出现人cdx2基因的表达。结果：酶切鉴定和测序显示靶基因cdx2克隆到pcDNA3.1质粒中,RT-PCR证实转染的人胃上皮细胞中有人cdx2基因的表达。结论：成功构建含有人cdx2基因的真核表达质粒。并在人胃上皮细胞中表达。     

Granulysin真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建颗粒溶解素(granulysin)cDNA真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出颗粒溶解素蛋白cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,将此重组质粒进行序列测定,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果:重组质粒插入基因序列测定证实为颗粒溶解素cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。结论:成功构建颗粒溶解素真核表达载体,为进一步研究其抗结核作用奠定了基础。     

人趋化因子受体CCR6的克隆、表达及其功能分析

目的构建人趋化因子受体6（CCR6）cDNA序列的真核表达载体．并在HEK293细胞中表达．为研究CCR6生物学功能和筛选CCR6拮抗剂奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人扁桃体克隆CCR6受体的DNA片段．并将该片段插入真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6；将该质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6转染HEK293细胞．用流式细胞术检测转染pcDNA3．1（＋）-CCR6质粒的HEK293细胞；采用体外趋化实验、钙流实验，验证转染pcDNA3.1（-）．CCR6质粒的HEK293细胞表面表达的CCR6的生物学活性。结果经RT-PCR获得了编码人CCR6受体的DNA片段．构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-CCR6：转染HEK293细胞．经流式细胞仪检测、趋化实验、钙流实验证实．表达CCR6的HEK293细胞具有趋化因子受体CCR6的生物学活性。结论重组人趋化因子受体CCR6克隆成功．并在HEK293细胞中获得了表达．为研究CCR6的生物学功能及筛选CCR6拮抗剂奠定了基础。     

人宫颈癌Ca Ski 细胞 IL-24基因的克隆鉴定与真核表达

目的:克隆人IL-24基因并构建真核表达载体,转染Ca Ski细胞进行真核表达.方法:利用RT-PCR技术扩增出Ca Ski细胞中的IL-24基因.将IL-24基因克隆人pcDN3.1( )中,构建真核表达质粒pcDN3.1( )-hIL-24的表达.结果:PCR及测字结果均证实在功克隆了人IL-24,该质粒被转染人Ca Ski细胞中能表达出hIL-24蛋白.结论:成功构建了hIL-24基因的真核表达载体.     

结核杆菌cfp10真核载体的构建、表达与基因免疫

目的: 构建以结核分枝杆菌H37Rv cfp10基因为基础的基因疫苗. 方法: 采用BamH I和Xba I双酶切质粒pGEM-Teasy-CFP10中,10 g*L-1琼脂糖凝胶电泳回收约300 bp大小片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3.1的相应酶切位点. 阳性克隆提取质粒,体外电穿孔转化CHO细胞,RT-PCR法检测cfp10特异的mRNA的表达. 质粒肌注免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中相应抗体的滴度. 结果: 用BamH I和XbaⅠ酶切鉴定证实目的基因正确插入载体pcDNA3.1,命名为pcCFP10; pcCFP10转化的CHO细胞RNA提取物中,RT-PCR扩增出300 bp大小的条带. 肌注免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中相应抗体平均滴度为1∶ 4,000. 结论: 以CFP10的编码基因为基础的真核表达质粒的构建成功.     

SOCS－3基因真核载体的构建及瞬时表达鉴定

目的构建含小鼠细胞因子信号抑制蛋白-3（SOCS-3）基因的重组pcDNA3.1质粒,同时瞬时转染后,鉴定其在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达。方法自小鼠肝脏标本中提取RNA进行RT—PCR,经克隆后获得pUC19-SOCS-3质粒,从中切出目的基因片段克隆至质粒pcDNA3．1中,以构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3。后将构建完成的质粒瞬时转染COS-7细胞株,并随机分为未转染质粒组（对照组）、转染空质粒组和转染重组SOCS-3基因质粒组,同时采用免疫印迹法测定SOCS-3的表达。结果经测序鉴定证实,SOCS-3与美国国立生物技术信息中心核苷酸序列数据库提供的原始序列完全一致;同时经瞬时转染COS-7细胞后,转染重组质粒组的SOCS-3蛋白表达水平（光密度比值）显著高于对照组和转空质粒组（P〈0．01）。结论成功构建含小鼠SOCS-3基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在脂肪代谢中的抑制调节作用提供了技术平台。     

结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗并对其在体外进行表达。方法：用PCR技术从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以Hindm和EcoR Ⅰ双酶切后克隆人含esat6基因的pGEM-7zf( )载体中,将测序正确的esat6-cfp10融合基因按照BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点亚克隆人真核表达载体pcDNA3．1( ),重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体转染CHO细胞,分别以RT—PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达．结果：PCR获得的cfp10基因序列与献报道一致,大小约为350bp．重组真核表达质粒酶切后可获得约630bp的融合esat6-cfp10基因片段．RT—PCR可获得大小约为350bp的诉CFP10基因,间接免疫荧光检测后表达有Esat6-Cfp10蛋白的阳性细胞着染．结论：成功克隆结核分枝杆菌CFP10基因,构建了融合有esat6-cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行了表达。