三氧化二砷对MRL/lpr狼疮小鼠脾脏CD4~＋T细胞IFN-γ基因启动子甲基化的影响

目的：观察三氧化二砷（ATO）对MRL/lpr狼疮小鼠脾脏CD4＋T细胞IFN-γ基因启动子甲基化的影响。方法：免疫磁珠法分选16～18周MRL/lpr狼疮小鼠和C57BL/6J正常对照小鼠脾脏CD4＋T细胞,PHA-p（20μg/mL）和IL-2（1 000 IU/mL）刺激48 h后分为以下不同药物处理组：①PBS组：空白对照;②ATO组：1μmol/L ATO作用24 h;③ATO＋5-氮杂胞苷（5-AzaC）组：1μmol/L 5-AzaC作用72 h后1μmol/L ATO作用24 h。CD4＋T细胞经过以上处理后抽提基因组DNA,亚硫酸氢盐修饰,PCR扩增IFN-γ基因启动子,产物凝胶回收,克隆入pMD-19T载体,转化入E.coli DH5α,筛选阳性克隆测序,测序结果采用生物信息学软件进行分析。结果：①MRL/lpr小鼠脾脏CD4＋T细胞IFN-γ基因启动子呈低甲基化水平。②1μmol/LATO作用24 h后MRL/lpr小鼠脾脏CD4＋T细胞IFN-γ基因启动子甲基化水平明显增高。③1μmol/L ATO作用24 h能使经过5-AzaC干预后的MRL/lpr小鼠脾脏CD4＋T细胞IFN-γ基因启动子甲基化水平明显增高。结论：1μmol/L ATO作用24 h能在一定程度上有效逆转活化状态下MRL/lpr小鼠脾脏CD4＋T细胞IFN-γ基因启动子低甲基化。     

三氧化二砷对MRL/lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞 IFN-γ表达及其mRNA的影响

目的:观察三氧化二砷(ATO)对MRL/lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞分泌IFN -γ及其mRNA的影响.方法: 免疫磁珠分别分选18～20周MRL/lpr狼疮小鼠和C57BL/6J正常对照小鼠脾脏CD4+T细胞,采用流式细胞术鉴定细胞纯度.PHA-p(20μg/mL)和IL-2(1000IU/mL)常规刺激48h后进行如下实验: (1)不同浓度ATO(0.5、1.0和2.0μmol/L)作用24h;(2)1 μmol/LATO作用不同时间(12、24和48h);(3)不同药物处理组:①PBS组:空白对照;②ATO组:1 μmol/LATO;③5-氮杂胞苷(5-AzaC)组:1μmol/L 5-AzaC;④ATO+5-AzaC组:1μmol/LATO+1μmol/L 5-AzaC.酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养上清液IFN-γ的表达量;实时荧光定量PCR法检测不同药物处理组中IFN -γmRNA的表达情况.结果:①1.0μmol/LATO作用24h对细胞存活率无明显影响.②1mmol/lATO作用24h能抑制MRL/lpr小鼠脾脏CD4+T细胞 IFN-γ的转录和翻译水平.③经5-AazC处理后MRL/lpr和C57BL/6J小鼠脾脏CD4+T细胞IFN -γ的转录和翻译水平升高,1mmol/LATO作用24h能抑制其异常活化状态.④MRL/lpr小鼠脾脏CD4+T细胞IFN -γ的分泌和表达水平均较C57BL/6J小鼠明显升高.结论: 1mmol/L ATO作用24h能在一定程度上有效抑制活化状态下MRL/lpr小鼠脾脏CD4+T细胞IFN -g的异常分泌,下调其mRNA表达水平而不影响其存活率.     

复方肾怡治疗狼疮肾炎小鼠的疗效及对补体旁路途径激活的研究

背景 狼疮肾炎（LN）是系统性红斑狼疮严重并发症之一,相关研究表明中药复方肾怡（SY）可以调节机体免疫及抑制肾脏纤维化。目前运用复方SY治疗LN的疗效及机制尚不清楚。 目的 探究复方SY对LN小鼠的治疗作用及补体旁路途径激活的影响。 方法 2021年4—7月,选取35只SPF级MRL/lpr小鼠（8周龄）、6只SPF级C57BL/6J小鼠（8周龄）进行实验。将MRL/lpr小鼠依据随机数字表法分为MRL/lpr组（n=8）及SY低剂量组（n=9）、SY中剂量组（n=9）、SY高剂量组（n=9）,C57BL/6J小鼠为正常对照组（n=6）。SY低、中、高剂量组分别以15.34、46.02、92.04 g/kg剂量进行复方SY汤剂灌胃,正常对照组及MRL/lpr组以0.5 ml 0.9%氯化钠溶液灌胃。从小鼠12周龄开始干预,1次/d,持续14周。观察各组动物体征,检测尿蛋白与肌酐比值（UPCR）,血清抗双链DNA抗体（anti-dsDNA）、抗核抗体（ANA）水平,肾脏组织病理情况,肾脏组织C3、免疫球蛋白G（IgG）、C5b-9免疫沉积情况,肾脏组织α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）、Fibronectin及补体蛋白水平。 结果 截至干预结束,正常对照组6只小鼠存活,MRL/lpr组3只小鼠存活,SY低、中、高剂量组分别有5、7、9只小鼠存活。（1）正常对照组、SY中剂量组、SY高剂量组小鼠体征量化分值均低于MRL/lpr组（P<0.05）。（2）正常对照组、SY各剂量组小鼠干预第9、10、11、12、13周UPCR均低于MRL/lpr组（P<0.05）。（3）正常对照组、SY低剂量组、SY高剂量组小鼠干预14周后血清anti-dsDNA水平低于MRL/lpr组（P<0.05）;正常对照组、SY各剂量组小鼠干预14周后血清ANA水平低于MRL/lpr组（P<0.05）。（4）干预14周后,HE染色可见MRL/lpr组小鼠肾小球内有免疫复合物沉积,PAS染色可见肾小球内有新月体形成;HE染色可见SY各剂量组小鼠肾小球大致正常,而PAS染色可见SY中、高剂量组小鼠肾小球内有系膜细胞增生,伴少量炎细胞浸润。（5）正常对照组、SY各剂量组小鼠干预14周后肾脏组织C3、C5b-9沉积低于MRL/lpr组（P<0.05）;SY低剂量组、SY高剂量组小鼠干预14周后肾脏组织IgG免疫沉积低于MRL/lpr组（P<0.05）。（6）SY高剂量组小鼠干预14周后肾脏组织CollagenⅠ、Fibronectin 、C3、C5、CD35蛋白水平低于MRL/lpr组（P<0.05）;SY低、中剂量组小鼠干预14周后肾脏组织Fibronectin、C3、C5、CD35蛋白水平低于MRL/lpr组（P<0.05）;正常对照组小鼠干预14周后肾脏组织Fibronectin蛋白水平低于MRL/lpr组（P<0.05）。 结论 复方SY可改善MRL/lpr小鼠狼疮肾脏损伤,延缓疾病进展,其作用机制可能是通过抑制补体旁路途径的激活。     

三氧化二砷对MRL／1pr狼疮小鼠脾脏CD4＋T细胞IFN-γ表达及其mRNA的影响

目的：观察三氧化二砷（ATO）对MRL／1pr狼疮小鼠脾脏CD4＋T细胞分泌IFN-γ及其mRNA的影响。方法：免疫磁珠分别分选18—20周MRL／1pr狼疮小鼠和C57BL／6J正常对照小鼠脾脏CD4＋T细胞,采用流式细胞术鉴定细胞纯度。PHA-P（20μg／mL）和IL-2（1000IU／mL）常规刺激48h后进行如下实验：（1）不同浓度ATO（0.5、1.0和2.0μmol／L）作用24h;（2）1μmol／LATO作用不同时间（12、24和48h）;（3）不同药物处理组：①PBS组：空白对照;②ATO组：lumol／LATO;③5-氮杂胞苷（5-AzaC）组：1μmol／L 5-AzaC;④ATO＋5-AzaC组：1μmol／LATO＋1μmol／L 5-AzaC。酶联免疫吸附法（ELISA）测定培养上清液IFN-γ的表达量;实时荧光定量PCR法检测不同药物处理组中IFN-γ mRNA的表达情况。结果：①1.0μmol／LATO作用24h对细胞存活率无明显影响。②1mmol／l AT0作用24h能抑制MRL／1pr小鼠脾脏CD4＋T细胞IFN-γ的转录和翻译水平。③经5-AazC处理后MRL／1pr和C57BL／6J小鼠脾脏CD4＋T细胞IFN-γ的转录和翻译水平升高,1mmol／L ATO作用24h能抑制其异常活化状态。④MRL／1pr小鼠脾脏CD4＋T细胞IFN-γ的分泌和表达水平均较CS7BL／6J小鼠明显升高。结论：1mmol／L ATO作用24h能在一定程度上有效抑制活化状态下MRL／1pr小鼠脾脏CD4＋T细胞IFN-g的异常分泌,下调其mRNA表达水平而不影响其存活率。     

骨髓间充质干细胞输注对MRL/lpr狼疮鼠B淋巴细胞CXCR4表达的影响

目的：研究骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）输注对狼疮鼠血浆C3、IgG浓度及B细胞、浆细胞表面CXCR4表达的影响,分析BMMSCs改善系统性红斑狼疮疾病活动的机制。方法：分离培养C57BL/6小鼠的BMMSCs,并对MRL/lpr 狼疮鼠进行尾静脉输注。实验分为C57BL/6组（C57BL/6小鼠未进行尾静脉输注）、MRL/lpr组（MRL/lpr鼠未进行尾静脉输注）、BMMSCs组（MRL/lpr鼠12周龄注射BMMSCs）和PBS 组（MRL/lpr鼠12周龄注射PBS）。在20周末取小鼠的外周血、骨髓、脾脏进行流式细胞分析,检测B细胞、浆细胞表面CXCR4表达;同时取4组血浆,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测C3、 IgG浓度。取小鼠肾脏组织行苏木精伊红（HE）染色。结果：① MRL/lpr组较C57BL/6组小鼠血浆C3浓度明显降低、IgG浓度明显增高（P均<0.01）;MRL/lpr组较C57BL/6组小鼠B细胞表面CXCR4的表达在外周血明显下降,在骨髓和脾脏明显升高（P均<0.01）;MRL/lpr组小鼠骨髓（P<0.05）及脾脏（P＜0.01）浆细胞表面CXCR4表达明显高于C57BL/6小鼠。② BMMSCs组较PBS组、MRL/lpr组C3浓度明显升高、IgG浓度明显降低（P均<0.01）; BMMSCs组较PBS组B细胞表面CXCR4表达在外周血明显增加（P<0.01）,在骨髓（P<0.01）和脾脏（P<0.05）明显下降, 较MRL/lpr组在骨髓和脾脏均明显下降（P均<0.01）。③ BMMSCs组较PBS组、MRL/lpr组浆细胞表面CXCR4表达在骨髓和脾脏均明显降低（P均<0.05）。④ 肾脏HE染色提示输注BMMSCs后狼疮鼠肾脏炎症改善。结论：BMMSCs输注可调节B细胞、浆细胞表面CXCR4的表达,改善MRL/lpr鼠病情活动指标。     

静脉注射免疫球蛋白对MRL/lpr小鼠外周血NK细胞的影响

目的 研究静脉注射免疫球蛋白对MRL/lpr小鼠蛋白尿及外周血自然杀伤（NK）细胞的影响。方法 MRL/lpr小鼠随机分为免疫球蛋白治疗组（尾静脉注射丙种球蛋白4 μL/kg×5 d）和对照组（尾静脉注等量生理盐水）。两组小鼠治疗前后分别进行24 h尿蛋白定量和血常规检测,流式细胞术检测外周血NK细胞数量。结果 与治疗前比较,治疗后免疫球蛋白治疗组MRL/lpr小鼠24 h尿蛋白定量明显减少（P<0.05）,外周血NK细胞比例明显上升（P<0.05）;而对照组MRL/lpr小鼠治疗前后24 h尿蛋白定量和外周血NK细胞比例无明显变化(P>0.05)。结论 静脉注射免疫球蛋白可有效改善MRL/lpr小鼠的蛋白尿症状,其作用机制可能与增加外周血NK细胞数量有关。     

中药狼疮定方对MRL/lpr小鼠外周血淋巴细胞凋亡和Bcl-2/Bax基因表达的影响

目的探讨中药狼疮定方对MRL/lpr小鼠外周血淋巴细胞（PBLC）凋亡及其Bcl-2/BaxmRNA表达的影响。方法将80只MRL/lpr小鼠随机分为模型组、中药组、西药组和中西药组,分别以0.9%氯化钠溶液、狼疮定悬液、强的松混悬液、狼疮定悬液联合强的松混悬液灌胃;另取20只正常昆明小鼠以0.9%氯化钠溶液灌胃。连续饲养用药12周后取血,以梯度离心法分离外周血单个核细胞,培养48h后取PBLC悬液,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;另以RT-PCR法检测PBLC中Bcl-2/BaxmRNA的表达水平。结果正常组、中药组、西药组和中西药组PBLC培养0h和48h时凋亡率高于模型组（P〈0.05或0.01）,0h时西药组、正常组与中西药组的PBLC凋亡率无明显差异,但中药组和模型组凋亡率显著低于中西药组（P〈0.05）,48时中药组、模型组和西药组凋亡率明显低于中西药组（P〈0.05或0.01）;正常组、中药组和中西药组PBLC中Bcl-2/BaxmRNA比值水平均明显低于模型组和西药组（P〈0.05或0.01）。结论狼疮定方对MRL/lpr小鼠的PBLC凋亡率及其Bcl-2/Bax比值均可起到调节作用。     

MRL/lpr小鼠肾组织胸腺和活化调节趋化因子表达检测

目的研究胸腺和活化调节趋化因子(TARC)在红斑狼疮小鼠肾组织中的表达与作用。方法16周龄MRL/lpr小鼠和BALB/c小鼠各4只,比较两组小鼠24h尿蛋白,并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和蛋白印迹的方法检测两组小鼠肾组织中TARC mRNA及蛋白表达情况。结果MRL/lpr小鼠24h尿蛋白高于BALB/c小鼠(P<0.05);MRL/lpr小鼠肾组织TARC mRNA表达较BALB/c小鼠明显升高(P<0.05);MRL/lpr小鼠肾组织中可检测出TARC蛋白条带,而BALB/c小鼠肾脏组织中未能测得。结论TARC在红斑狼疮小鼠肾脏组织中表达增高,并可能参与介导小鼠狼疮性肾炎的发病。     

MRL／lpr小鼠肾组织MCP-1表达及MMF对其表达的影响和相关机制研究

目的：检测MRL／lpr狼疮小鼠肾组织单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达及探讨霉酚酸酯（MMF）对其影响和相关机制,研究MMF对MRL／lpr狼疮小鼠的治疗作用。方法：MRI/lpr狼疮小鼠分为对照组和治疗组两组。观察肾组织病理学改变及其MCP-1、CD14和蛋白激酶C（PKC）等的表达以及尿蛋白、抗ds—DNA抗体水平的变化。结果：对照组小鼠肾小球基底膜增厚,系膜基质增多,肾组织MCP-1表达上调,CD14^＋细胞数明显增多,伴尿蛋白及抗ds—DNA抗体水平增加。治疗组小鼠肾组织MCP—l表达减少,CD14^＋细胞数减少,尿蛋白和抗ds—DNA抗体水平减少,且肾小球MCP-1与其PKC表达水平及肾小球CD14^＋细胞数、尿蛋白水平呈直线相关关系。结论：MMF对MRL／lpr小鼠自发狼疮肾炎具有治疗作用,其机制可能通过抑制PKC通道激活减少小鼠肾组织MCP-1的表达,从而减少肾组织单核细胞的浸润,减轻肾脏损害。     

DNA甲基转移酶1与CD11a基因在系统性红斑狼疮患者中mRNA水平的表达

 目的 检测系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）患者中DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1,DNMT1）和CD11a基因的表达水平,探讨DNMT1的表达异常在SLE发病中的作用。方法 用Real-time PCR方法测定SLE患者缓解期、活动期和正常人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中DNMT1和CD11a基因的表达水平。结果 SLE活动期患者PBMC中DNMT1的表达水平较对照组（P=0.014）和缓解期组（P=0.030）显著下降;缓解期的DNMT1表达水平与对照组（P=0.264）相比差异无统计学意义;SLE患者DNMT1的表达水平与SLE疾病活动指数（SLE disease activity index,SLEDAI）呈现负相关（P<0.05）。SLE活动期患者PBMC中CD11a的表达水平较对照组（P=0.003）显著升高（P<0.05）;缓解期的CD11a表达水平与对照组（P=0.250）和缓解期组（P=0.069）相比差异无统计学意义（P>0.05）;SLE患者CD11a的表达水平与SLEDAI呈正相关（P<0.05）。SLE患者DNMT1与CD11a的表达水平无显著相关性（P>0.05）。结论 SLE患者PBMC中DNMT1表达水平的降低可能是造成基因组DNA低甲基化的重要原因,使得CD11a等致病基因过度表达,进而导致SLE发病。     

信号传导和转录激活因子3及其蛋白抑制剂在狼疮小鼠肾组织中的表达

目的探讨信号传导和转录激活因子3(STAT3)及其蛋白抑制剂(PIAS3)在MRL/lpr狼疮小鼠肾组织中的表达。方法以18周龄雌性MRL/lpr小鼠作为狼疮肾炎组,相同周龄的BALB/C小鼠作为正常对照组。分别取两组小鼠肾组织,应用荧光定量RT-PCR法检测STAT3和PIAS3 mRNA的表达,采用Western blot和免疫组织化学方法检测磷酸化STAT3(p-STAT3)和STAT3的蛋白表达,同时检测小鼠实验室指标以及肾脏组织病理的表现。结果 MRL/lpr小鼠尿蛋白、血尿素氮、血肌酐均高于BALB/C小鼠(P<0.05)。MRL/lpr小鼠肾脏组织病理主要表现为肾小球系膜细胞增生,肾小管间质炎症细胞浸润,而BALB/C小鼠肾小球、肾小管无异常。MRL/lpr小鼠肾组织STAT3 mRNA和p-STAT3蛋白的表达均较BALB/C小鼠升高(P<0.05),其PIAS3mRNA表达则较BALB/C小鼠明显降低(P<0.01),而两组小鼠STAT3总蛋白的表达无明显差别。结论 MRL/lpr小鼠肾组织STAT3 mRNA和p-STAT3蛋白的表达均高于对照组,而其PIAS3 mRNA表达低于对照组。     

解毒祛瘀滋阴方对MRL／lpr小鼠粘附分子表达的影响

目的探讨解毒祛瘀滋阴方可能的作用机制。方法以MRL/lpr小鼠80只,分成4组采用RT—PCR技术检测各组肾组织ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达水平。结果解毒祛瘀滋阴方合用激素组ICAM-1和VCAM—1mRNA表达低于其他各组。结论解毒祛瘀滋阴方合用激素能有效降低MRL／lpr小鼠肾组织ICAM-1和VCAM—1mRNA表达水平。     

MRL/lpr小鼠肾组织MCP-l表达及MMF对其表达的影响和相关机制研究

目的:检测MRL/lpr狼疮小鼠肾组织单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达及探讨霉酚酸酯(MMF)对其影响和相关机制,研究MMF对MRL/lpr狼疮小鼠的治疗作用.方法:MRL/lpr狼疮小鼠分为对照组和治疗组两组.观察肾组织病理学改变及其MCP-1、CD14和蛋白激酶C(PKC)等的表达以及尿蛋白、抗ds-DNA抗体水平的变化.结果:对照组小鼠肾小球基底膜增厚,系膜基质增多,肾组织MCP-1表达上调,CD14+细胞数明显增多,伴尿蛋白及抗ds-DNA抗体水平增加.治疗组小鼠肾组织MCP-1表达减少,CD14+细胞数减少,尿蛋白和抗ds-DNA抗体水平减少,且肾小球MCP-1与其PKC表达水平及肾小球CD14+细胞数、尿蛋白水平呈直线相关关系.结论:MMF对MRL/lpr小鼠自发狼疮肾炎具有治疗作用,其机制可能通过抑制PKC通道激活减少小鼠肾组织MCP-1的表达,从而减少肾组织单核细胞的浸润,减轻肾脏损害.     

解毒祛瘀滋阴方对MRL/lpr狼疮鼠CD4+T细胞DNA甲基化敏感基因表达的影响

目的:观察解毒祛瘀滋阴方对MRL/lpr狼疮鼠CD4~+T细胞DNA甲基化敏感基因白介素10(IL-10)、蛋白磷酸酶2Ac(protein phosphatase 2Ac,PP2Ac)、CD70表达水平的影响。方法:40只MRL/lpr狼疮小鼠随机分为对照组和解毒祛瘀滋阴方中药组,分别予解毒祛瘀滋阴方中药和生理盐水灌胃8周。干预结束后,观察小鼠皮损及血清抗ds DNA抗体、C3浓度、尿蛋白水平变化;HE染色及荧光染色后观察肾脏病理改变;荧光定量PCR检测小鼠脾脏CD4~+T细胞甲基化敏感基因CD70、PP2Ac、IL-10 mRNA表达水平。结果:与对照组比较,中药组小鼠血清抗ds DNA抗体、C3浓度和肾脏病理损伤明显改善,CD70、PP2Ac和IL-10的mRNA表达水平明显降低(P0.05)。结论:解毒祛瘀滋阴方具有对MRL/lpr狼疮鼠的治疗作用,其作用机制可能与其抑制下游甲基化敏感基因CD70、PP2Ac、IL-10的过度表达有关。     

MRL/lpr狼疮鼠骨TNF-α/NF-κB信号通路的表达

目的: 探讨系统性红斑狼疮小鼠(MRL/lpr)骨肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)/细胞核因子-κB p50 (nuclear factor-κB p50,NF-κB p50)信号通路的表达。方法: 选取C3He/HeJ小鼠(对照组)和MRL/lpr狼疮小鼠(狼疮组)各6只,饲养4个月后常规制备小鼠股骨组织切片,HE染色观察骨质情况,免疫组织化学染色检测TNF-α、NF-κB p50蛋白表达情况;密度梯度离心法分离和贴壁法筛选骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs),然后培养;免疫细胞化学染色观察BMMSCs中TNF-α、NF-κB p50表达情况。结果： 与对照组比较,狼疮组小鼠骨小梁松散,出现骨质疏松,股骨TNF-α和NF-κB p50蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01),BMMSCs中TNF-α和NF-κB p50蛋白表达亦升高(P<0.05或P<0.01)。结论：狼疮鼠骨TNF-α/NF-κB信号通路处于异常活化状态。