应用MSP方法检测非小细胞肺癌RASSFlA基因启动子甲基化

目的探讨应用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测非小细胞肺癌（NSCLC）RASSF1A基因启动子甲基化情况。方法留取58例非小细胞肺癌患者手术标本及正常肺组织，甲基化特异性PCR分析RASSF1A基因启动子甲基化情况。结果58例非小细胞肺癌中RASSF1A基因启动子甲基化阳性率为34．5％，甲基化与各临床参数之间无显著相关性。结论原发性非小细胞肺癌中存在着较高比例的RASSF1A启动子过度甲基化，提示RASSF1A在非小细胞肺癌的发生中起着重要作用。     

熔解曲线法用于肺癌APC基因甲基化模式的研究

目的 以熔解曲线法测定4株肺癌细胞株和肺癌病人APC基因启动子区的甲基化模式.方法 以脐血淋巴细胞DNA及其转甲基后的DNA经化学修饰、克隆测序的质粒,作为完全非甲基化和完全甲基化标准品.设计通用引物,采用加入荧光染料SYBR Green I的荧光定量PCR法扩增包含21个CpG位点的APC基因启动子区的目的序列,以熔解曲线法通过与完全非甲基化和完全甲基化标准品的Tm值比较,确定四株肺癌细胞株(NCI-H446,NCI-H460,SPCA1,NCI-H520)在该区段的甲基化模式,并通过克隆测序验证.同时测定两例肺癌患者癌组织中APC基因启动子区甲基化模式.结果 四株肺癌细胞株中,NCI-H446,SPCA1和NCI-H520的Tm值与完全非甲基化标准品的Tm值相同,而NCI-H460的Tm值有两个,分别与完全非甲基化和完全甲基化标准品的Tm值吻合,并经克隆测序验证.两例肺癌患者癌组织的Tm值位于完全非甲基化和完全甲基化标准品的Tm值之间.结论 小细胞肺癌细胞株NCI-H446,肺腺癌细胞株SPCA1和肺鳞癌细胞株NCI-H520的APC基因启动子区为完全未甲基化型,而大细胞肺癌细胞株NCI-H460APC基因启动子区甲基化模式为等位基因杂合型.两例肺癌患者癌组织中的APC基因启动子均为部分甲基化型.熔解曲线法是简单、经济和实用的甲基化模式检测方法.     

芯片技术用于APC基因启动子甲基化定量检测

目的研制抑癌基因APC启动子1A的甲基化定量检测芯片,对临床标本进行初步定量检测分析。方法采用脐带血DNA克隆体作为阴性、阳性质控品建立芯片,提取6例健康人的肺组织DNA、6例肺癌患者的肺组织和癌组织DNA,进行亚硫酸盐化学修饰,以甲基化特异性引物进行基因扩增,与探针杂交检测,并进行甲基化特异性序列分析。结果甲基化阳性、阴性质控品的芯片检测与测序结果吻合。687、707、714、719和726共5个位点的荧光强度标准曲线的R2为0．93-0．99。687、707、714、719和726共5个位点非甲基化的检测范围:(0±8．7)％、(0±17．6)％、(0±17)％、(0±13)％、(0±8)％;甲基化杂合型的检测范围:(50±3．6)％、(50±6．9)％、(50±3．5)％、(50±8．5)％、(50±7．3)％。标本的芯片检测与测序结果一致。结论本研究首次建立了以微阵列技术为基础的APC基因启动子甲基化定量检测芯片。     

抑癌基因APC启动子甲基化检测及其在肺癌诊断中的应用

目的　建立抑癌基因APC启动子部位甲基化的检测方法 ,并对肺癌临床样品进行初步检测研究。方法 :对肺癌组织提取的DNA及转甲基后的脐带血DNA进行化学修饰 ,以甲基化特异性引物进行基因扩增 (methylationspecificPCR ,MSP)和甲基化序列分析 (methylationsequencing ,MS)。结果 :经转甲基的人脐带血DNA样品MSP检测为阳性 ,其序列与预期相符 ,未经转甲基样品为阴性。 17例肺癌患者的肿瘤及其正常肺组织APC甲基化检测阳性率分别为 4 7% (8/ 17)和 18% (3/ 17) ,1例肺部良性肿瘤及其正常肺组织的检测结果均为阴性 ;对MSP检测为阴性的 9例肺癌患者肿瘤及其正常肺组织进行MS检测分析 ,有 4例APC启动子部位存在CpG甲基化。结论 :利用MSP和MS两种甲基化检测分析手段 ,对 17例临床确诊肺癌组织的检测总阳性率可达 71% (12 / 17)。MSP操作简便 ,价格低廉 ,可适合于大规模肿瘤患者样本的筛查 ;而对于MSP检测为阴性的临床样品 ,可以利用MS进行进一步的确认 ,为临床肺癌诊断提供更准确的信息。     

肺癌患者血浆RASSF1A和BLU基因甲基化检测及临床意义

【目的】探讨肺癌患者外周血血浆中抑癌基因Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）和BLU基因启动子的甲基化状态及其临床意义。【方法】利用巢式甲基化特畀性PCR（nMSP）法检测肺癌患者外周血血浆与正常人血浆中抑癌基因RASSF1A和BLU基因启动子的甲基化状态。【结果】58例肺癌患者血浆样品中分别发现22例（37．93％）RASSF1A基因启动子的异常甲基化和17例（29．31％）BLU基因启动予的异常甲基化,20例正常对照血浆中都未检测到RASSF1A和BLU基因启动子的异常甲基化,差异有显著性（P〈0．01）;但血浆中两基因甲基化检出率与患者性别、肺癌组织学分型及临床分期无明显相关性（P〉0．05）。【结论】利用nMSP法检测外周血血浆中RASSF1A和BLU基因启动子的甲基化,可为肺癌的筛查、早期诊断提供有用的信息。     

骨肉瘤组织与血浆中RASSF1A甲基化的检测及其临床诊断意义

【目的】寻求有助于骨肉瘤临床诊断的分子生物学标志物。【方法】甲基化特异性 PCR 法检测30例骨肉瘤患者肿瘤组织和血浆及15例健康志愿者骨组织和血浆中 RASSF1A 启动子甲基化情况。统计分析RASSF1A 甲基化与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤分化、肿瘤转移等临床病理特征的相关性。【结果】正常骨组织及血浆中均未检测到 RASSF1A 基因启动子区的甲基化。骨肉瘤组织中 RASSF1A 甲基化阳性率为40％（12／30）,血浆甲基化阳性率为26．7％（8／30）。12例肿瘤组织甲基化阳性患者其血浆甲基化阳性共8例,癌组织和血浆 RASSF1A 甲基化一致率为66．7％（8／12）,18例癌组织甲基化阴性其血浆甲基化也为阴性,Kappa 一致性检验显示骨肉瘤组织和血浆中 RASSF1A 甲基化水平具有一致性（κ＝0．133,P ＜0．05）。骨肉瘤组织及血浆中 RASSF1A 甲基化阳性率显著高于正常骨组织及血浆的甲基化阳性率（ P ＜0．05）,且骨肉瘤组织和血浆中 RASSF1A 甲基化水平与患者的性别、年龄、肿瘤位置无关（ P ＞0．05）,而与肿瘤的分化及有无远处转移有关（ P ＜0．05）。【结论】骨肉瘤患者血浆中 RASSF1A 启动子甲基化与骨肉瘤组织中变化具有一致性,可作为骨肉瘤患者临床诊断的一个辅助指标。     

Runx3基因启动子区甲基化与胃癌的关系

目的通过检测胃癌Runx3基因启动子区域甲基化状态，来探讨Runx3基因启动子区域甲基化在胃癌发生和发展过程中的临床意义。方法采用DNA甲基化特异性PCR（MSP）技术对37例胃癌患者手术切除肿瘤组织及其癌旁组织Runx3基因启动子区域甲基化进行检测。结果Runx3基因在37例胃癌及其癌旁组织中甲基化率分别为40．5％（15／37）和8％（3／37）。结论Runx3基因启动子区甲基化可能是肿瘤特异性的（P＜0．05），可作为胃癌早期诊断的分子标记物。     

人核心蛋白聚糖基因靶向肺癌细胞特异性表达载体的构建及其表达

目的构建调控人核心蛋白聚糖基因特异性在肺癌细胞A549内表达的基因表达载体,为进一步应用该基因进行肺癌靶向治疗的研究奠定实验基础。方法应用PCR技术从人外周血基因组中扩增肺癌细胞特异性表达的人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂的启动子,利用基因重组技术将该启动子插入真核细胞表达载体pcDNA3.1（＋）,替换该载体的CMV启动子与增强子序列,从而构建成由人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因的启动子启动基因表达的基因表达载体。将人核心蛋白聚糖基因通过基因重组技术插入到上述载体人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因启动子的下游。PCR产物通过测序鉴定核苷酸序列。重组载体通过限制性酶切进行鉴定。结果 PCR扩增的人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂的启动子片段长度为1 250 bp;该启动子经测序获得的核苷酸序列与Genebank上该基因上游5′末端转录调控区的序列完全一致;重组载体的酶切鉴定结果显示（1）该启动子成功插入到pcDNA3.1（＋）载体,并替换CMV启动子与增强子序列,（2）人核心蛋白聚糖基因成功插入该载体。结论成功构建由人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因启动子调控人核心蛋白聚糖基因表达载体,该载体实现调控人核心蛋白聚糖基因在肺癌细胞内特异性表达。     

Runx3基因在肝细胞癌中甲基化状态分析及临床意义

目的通过检测肝细胞癌组织中Runx3基因启动子区域甲基化状态,探讨Runx3基因启动子区域异常甲基化在肝细胞癌发生、发展过程中的临床意义。方法采用DNA甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）（MSP）技术对81例肝细胞癌患者肿瘤组织及其癌旁正常组织Runx3基因启动子区域甲基化状态进行检测。结果在肝细胞癌组织中,Runx3基因启动子区域甲基化率占43．2％（35／81）,而在相对应的癌旁正常组织中,Runx3基因启动子区域仅发现1例异常甲基化现象,其甲基化率占1．2％（1／81）（P〈0．01）;Runx3基因启动子区域甲基化状态与临床病理参数的关系差异均无统计学意义。结论Runx3基因启动子区域甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一,与肝细胞癌发生早期密切相关,可作为肝细胞癌早期诊断的分子标记物及分子治疗的靶点。     

卵巢上皮癌中DNA错配修复基因启动子区甲基化状态研究

目的探讨卵巢上皮癌中DNA错配修复基因（hMLH1、hMSH2）启动子区甲基化状态及其在卵巢癌发生发展中的作用。方法用甲基化特异性PCR（MSP）法检测20份正常卵巢组织，25份良性卵巢肿瘤，56份卵巢上皮癌中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态；同时检测5-氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR）处理前后卵巢癌细胞株SKOV3和3AO中hMLH1、hMSH2甲基化改变；逆转录（RT）-PCR法检测5-Aza—CdR（1μm/L）处理前后卵巢癌细胞株中hMLH1和hMSH2 mRNA表达水平。结果正常卵巢癌组织中均未见hMLH1、hMSH2启动子甲基化；良性卵巢肿瘤中hMLH1和hMSH2甲基化阳性率分别为4％（1／25）、8％（2／25）；卵巢上皮癌中hMLH1和hMSH2甲基化阳性率分别为30．4％（17／56）、51．8％（29／56）；且与肿瘤细胞的分化程度和淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。5-Aza—CdR处理卵巢癌细胞株后，可逆转hMLH1和hMSH2启动子区的甲基化，细胞株的hMLH1和hMSH2 mRNA表达均有不同程度的增加。结论DNA错配修复基因hMLH1、hMSH2甲基化为卵巢癌发生发展中的早期基因改变，有可能成为卵巢癌早期诊断、评价疗效和判定预后的分子生物学指标。hMLH1和hMSH2甲基化与mRNA表达密切相关，是表达调节的重要方式之一，这种改变可被甲基化酶抑制剂所逆转。     

甲基化在肺癌中的意义

目的探讨基因T-钙黏蛋白(CDH13)在40例癌组织,40例的癌旁组织标本和非肺癌良性肺切除组织标本15例作为对照的表达的临床意义,进一步研究其基因异常甲基化与肺癌的相关性。方法采用特异性甲基化PCR(MSP)检测该基因在肺癌组织中异常甲基化的水平。结果 1.在肺癌组织中CDH13基因甲基化率明显高于癌旁组织和非肺癌良性肺切除组织,甲基化率分别为32.5%、7.5%、6.7%,有统计学意义(P<0.05)。2.CDH13基因异常甲基化和CDH13的表达水平呈负相关性(r=-0.520).3.CDH13基因启动子区5’CpG岛甲基化阳性率在肺癌组织中显著高于癌旁组织和非肺癌良性肺切除组织,CDH13基因启动子区5’CpG岛甲基化导致了CDH13的表达下调。结论在肺癌组织中CDH13基因异常甲基化率明显升高且有临床诊断意义,CDH13基因在癌组织中的异常甲基化水平将有望成为肺癌新的治疗靶点。     

不同甲基化检测技术对模拟肺癌患者血浆中APC基因甲基化的检测

目的 研究模拟肺癌患者血浆DNA中APC基因甲基化最低检测限,确定不同甲基化检测技术在早期肺癌诊断中的价值.方法 用普通甲基化特异性基因扩增（methylation specific PCR,MSP）方法检测肺癌细胞株NCI-H460细胞APC基因,以酚-氯仿经典方法提取NCI-H460细胞DNA,紫外分光光度计定量并以10倍稀释的浓度梯度依次投入相同的健康人血浆200μl中去,得到模拟肺癌患者血浆,利用磁珠核酸提取方法从模拟血浆样本中提取血浆DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以Sybr-Green Ⅰ为染料进行实时荧光定量MSP检测,同时进行普通MSP检测.结果 NCI-H460细胞中的APC基因启动子1A区719位点存在甲基化,实时荧光定量MSP检测模拟肺癌患者血浆APC基因甲基化的最低检测限为在200 μl血浆中能检测出10^2个肿瘤细胞的DNA,而以普通MSP检测,200 μl血浆中需投入10^3个以上肿瘤细胞的DNA才有弱阳性条带.实时荧光定量MSP检测技术比普通MSP检测的敏感性至少高出10倍.结论 实时荧光定量MSP比普通MSP检测灵敏度高,该技术用于肺癌患者血浆DNA甲基化检测,可能有助于肺癌早期诊断.     

非小细胞肺癌血清8个抑癌基因启动子CpG岛甲基化的联合检测及意义

目的：探讨非小细胞肺癌患者血清中8个抑癌基因启动子C pG岛甲基化的联合检测在诊断非小细胞肺癌患者中的意义,以期提高非小细胞肺癌早期无创检出率,提升治愈率。方法选取62例非小细胞肺癌患者设为肺癌组,选取30例肺部良性疾病患者作为对照组,选取16例健康者作为健康组,取3个组研究对象的血清采取癌基因测序法检测8种基因启动子区域甲基化情况,比较3个组研究对象的上述指标,分析上述指标的变化和3个组研究对象不同临床状态的相关性。结果肺组结肠腺瘤性息肉病基因（A PC ）、钙粘蛋白13（CD H 13）、死亡相关蛋白激酶基因（DAPK）、人类O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）、RAS相关区域家族 F2（RASSF2）、人类Runt相关转录因子3（RUNX3）、RAS相关区域家族1A （RASSF1A）和TMS1/ASC基因甲基化检出率均明显高于对照组,组间比较差异具有统计学意义（P＜0．05）,非小细胞肺癌患者血清中抑癌基因8个指标联合检测敏感性达到93．54％,特异性达到90．3％,敏感性明显高于所有单项检测和4个指标联合检测。结论 A PC、CD H 13等8个抑癌基因异常甲基化状态的联合检测可以明显提高非小细胞肺癌患者抑癌基因甲基化的检出率。该8个基因异常甲基化有望成为非小细胞肺癌辅助诊断和预后判断的分子标记,并有可能成为非小细胞肺癌治疗的新靶点,从而提高临床对非小细胞肺癌患者的诊治水平。     

腺瘤样结肠息肉易感基因(APC)及结直肠癌缺失基因(DCC)基因甲基化在肺癌早期诊断的意义

目的 探讨腺瘤样结肠息肉易感基因(APC)及结直肠癌缺失基因(DCC)基因甲基化在肺癌早期诊断的意义。方法 对245例肺癌患者、150例非恶性肺病患者和40例健康志愿者抽取晨起空腹外周血,应用甲基化特异性PCR法检测APC和DCC启动子区甲基化状态。并对其与临床病理特征等进行相关性分析。结果 ①肺癌组患者外周血中APC及DCC启动子甲基化阳性率分别为26.53%(65/245)和36.33%(89/245); 非肺癌组患者外周血中APC及DCC启动子甲基化阳性率分别为2.67%(4/150)和8.00%(12/150); 健康志愿者外周血中APC及DCC启动子甲基化阳性率为0; 肺癌组与非肺癌组、健康志愿者组相比,APC和DCC基因甲基化检测结果比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。②APC及DCC基因甲基化联合检测,诊断肺癌灵敏度为52.65%,特异度为89.33%,联合检测与单独APC检测相比,敏感度与特异度差异均有统计学意义(P<0.01); 联合检测与单独DCC检测相比,敏感度有统计学差异(P<0.01),但是特异度差异不明显(P>0.05); ③甲基化检测结果与患者性别、年龄、病理类型、病理分化程度、临床TNM分期等没有相关性(P>0.05)。结论 APC和DCC基因甲基化与非小细胞肺癌的发生发展密切相关,可以作为肺癌早期诊断标志物之一。     

宫颈癌中FHIT基因CpG岛甲基化检测意义

目的探讨宫颈癌患者中脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad,FHIT）CpG岛甲基化状态及其在宫颈癌诊断中价值。方法采用甲基化特异性PCR技术检测45例宫颈癌组织及血浆中、10例正常宫颈组织中FHIT基因CpG岛甲基化状态。结果 FHIT基因在宫颈癌组织及血浆中CpG岛甲基化率分别为55.6%和35.6%,正常宫颈组织中未检测出FHIT基因CpG岛甲基化,宫颈癌组织及血浆中CpG岛甲基化改变与正常对照比较差异有统计学意义（P〈0.05）;癌组织中FHIT基因甲基化发生率与年龄、病理分级、临床分期间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 FHIT基因CpG岛甲基化检测在宫颈癌早期诊断中有一定价值。     

膀胱癌组织中上皮细胞钙依粘连蛋白基因启动子区CpG岛甲基化状态的分析

目的　探讨膀胱癌中肿瘤抑制基因上皮细胞钙依粘连蛋白(E cadherin)启动子区CpG岛的甲基化状 态及其与mRNA表达的关系。方法　收集30例新鲜的膀胱癌组织及其癌周正常组织;采用甲基化特异聚合酶 链反应(MSP)检测E cadherin基因启动子区CpG岛的甲基化状态;采用逆转录PCR检测E cadherin基因的mR NA表达。结果　E cadherin基因在膀胱癌组织中的甲基化阳性率(43.3%)显著高于在癌周正常组织中的甲基 化阳性率(6.7%,P<0.01);在复发性膀胱癌中的甲基化阳性率(64.7%)显著高于在原发性膀胱癌中的甲基化 阳性率(15.4%,P<0.05);在不同分级、分期膀胱癌中的差异无显著性。13例异常甲基化的膀胱癌组织中有10 例未检测到CDH1mRNA的表达,而13例未甲基化膀胱癌组织中有2例未检测到,二者差异有显著性(P< 0.01)。结论　E cadherin在膀胱癌组织中有一定程度的过甲基化,但与膀胱癌的临床分期和病理分级无显著相 关性,提示其可能参与了膀胱癌的发生;E cadherin基因CpG岛的过甲基化可能成为判断膀胱癌复发的指标之 一;E cadherin基因CpG岛的过甲基化可能是造成E cadherinmRNA不表达的原因之一。     

血浆中APC基因甲基化检测在早期肺癌诊断中的应用

目的 研究血浆DNA中APC基因启动子甲基化与肺部实体瘤良、恶性的关系,确定血浆中APC基因甲基化检测对早期肺癌诊断的意义.方法 以92例CT检查发现肺部实体瘤(直径≤2 cm),并在CT引导下行肺部穿刺患者和23例健康人作为研究对象,收集血浆样本,利用磁珠法提取DNA,行亚硫酸氢盐化学修饰后,采用针对APC基因启动子区的甲基化引物和探针,以荧光定量MSP法(TaqMan探针)检测APC基因的甲基化.结果 92例肺部实体瘤患者经病理诊断,有58例确诊为肺癌、31例为肺部良性疾病、3例未明确诊断.58例肺癌患者中有11例(19%)测出APC基因启动子区甲基化阳性,31例肺部良性疾病、3例未明确诊断和23例健康对照组均为阴性.结论 检测血浆DNA中APC基因启动子甲基化有助于早期肺癌的诊断.     

应用BSP克隆测序检测肝细胞癌组织中Dynamin 3基因启动子区域甲基化水平

目的检测原发性肝细胞癌组织Dynamin 3(DNM3)基因启动子区域36个CpG的甲基化水平,分析其与肝细胞癌患者临床病理特征的关系,探讨DNM3基因甲基化在肝癌形成过程中的作用。方法提取30对患者肝细胞癌组织和癌旁组织DNA,经亚硫酸氢盐处理后,进行巢式PCR并联合克隆测序检测DNM3基因的甲基化水平。结果肝细胞癌患者的甲基化事件发生率为83.3%(25/30)。癌组织的DNM3基因启动子区域平均甲基化率为37.8%,癌旁组织为12.0%,两者比较差异有统计学意义(P0.05)。DNM3基因甲基化诊断肝癌的受试者工作特征曲线(ROC)曲线下面积(AUC)为0.831,对肝癌有较好的诊断价值。结论 DNM3作为肝细胞癌的一种抑癌基因,其启动子区域高度甲基化可能会促进肝细胞癌的形成。     

结直肠癌C-erbB-2基因启动子CpG岛甲基化状态及其与C-erbB-2蛋白表达的关系

目的了解结直肠癌组织C-erbB-2基因启动子区CpG岛甲基化状态、C-erbB-2蛋白表达水平及两者之间的关系。方法取经病理确诊的43例结直肠癌组织和相应癌旁组织,分别用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和免疫组织化学法(IHC)检测C-erbB-2启动子区CpG岛的甲基化和C-erbB-2蛋白表达水平。结果癌组织和癌旁组织中C-erbB-2启动子区CpG岛甲基化率分别为44.2%和74.4%,差异具有统计学意义(P=0.004)。癌组织和癌旁组织中C-erbB-2蛋白过度表达率分别为67.4%和27.9%,差异具有统计学意义(P=0.000)。C-erbB-2蛋白表达水平与肿瘤分期相关。结直肠癌组织C-erbB-2启动子区CpG岛甲基化状态与C-erbB-2蛋白表达水平呈显著相关(r=0.331,P=0.03)。结论结直肠癌中C-erbB-2基因启动子区CpG岛的低甲基化可能在C-erbB-2蛋白过度表达中起一定作用,有望成为有用的肿瘤分子诊断标记和治疗靶点。