乙肝病毒PCR产物的鉴定及单项抗HBc阳性血清的HBV基因扩增

本文报道ＨＢＶ基因扩增产物的限制性酶切分析和寡核苷酸探针杂交鉴定、应用血清ＨＢＶＤＮＡ的ＰＣＲ扩增产物制备基因探针和单项抗ＨＢｃ阳性血清的ＨＢＶ基因扩增。ＰＣＲ用ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｗ３种亚型ＨＢＶ的Ｃ基因区共有序列为内外两对引物分单次或套式扩增，产物为６６ａｂｐ或４２８ｂｐ，两者序列中段共含－ＢｇＩⅡ酶切点并与一寡核苷酸探针同源。４２８ｂｐ产物被用以缺口平移标记３２Ｐ探针作斑点和转印杂交检测。结合分子杂交的ＰＣＲ结果从单项抗ＨＢｃ阳性的８／４２例慢性肝炎和２／１２例无症状受测者血清中检出ＨＢＶＤＮＡ，证实病毒低度复制和传染性。     

EBV－DNA酶全基因扩增克隆和鉴定

根据Ｂｅａｒ的ＥＢ病毒（ＥＢＶ）基因全序列，设计包括ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶全基因的一对引物，在引物上设计有一个ＳａｌⅠ切点，以便于克隆。选用蛋白酶Ｋ裂解的Ｒａｊｉ细胞ＤＮＡ为模板，扩增出一条１４６０ｂｐ的特异条带，纯比后经ＴａｑⅠ酶切形成１１９８ｂｐ和２６２ｂｐ的两个片段，证实该扩增片段即为ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶的全基因片段。以ＪＭ１０３为宿主菌，以高效表达质粒ＰＢＶ２２１为载体，按常规方法作酶切、连接、转化，最后在含氨中青霉素的培养基上挑取单菌落扩大培养，用快速法少量制备质粒ＤＮＡ。根据质粒电泳结果粗筛，再行ＢａｍＨⅠ酶切初步鉴定，确定质粒大小为５１１７（１４５１＋３６６６）ｂｐ的菌落为阳性克隆。先后用ＢａｍＨⅠ和ＴａｑⅠ消化阳性重组体，以形成１２００ｂｐ和３９１７ｂｐ两片段的确定为正向连接重组体。本实验首次将ＥＢＶ－ＤＮＡ酶全基因片段克隆到高效表达载体ｐＢＶ２２１上获得成功     

病毒与人类基因组同源性实探

探讨病毒与人类基因组同源性问题。选用ＥＢ病毒（ＥＢＶ），肠道病毒（ＥＶｓ）、单纯疱疹病毒－１型（ＨＳＶ－１），丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）特异性引的，以６份健康成人外周血ＤＮＡ为模板，分别进行酶链式反应（ＰＣＲ）。初步结果表明，有５份ＤＮＡ样品可通过ＥＢＶ、ＨＣＶ特异性引物扩增，ＥＢＶ引物扩增后的片段大小在１５４－２３４ｂｐ之间；ＨＣＶ引物扩增的片段大小约２００ｂｐ和１２０ｂｐ。提示病毒某些基因可能存在     

EBV—DNA酶全基因扩增克隆和鉴定

根据Ｂｅａｒ的ＥＢ病毒基因全序列，设计包括ＥＢＶ特生ＤＮＡ酶全基因的一对引物，在引物上设计有一相ＳａｌⅠ切点，以便于克隆，选用蛋白酶Ｋ裂解的Ｒａｊｉ细胞ＤＮＡ为模板，扩增出一１４６０ｂｐ的特异条带，纯化后经ＴａｑⅠ酶切形成１１９８ｂｐ和２６２ｂｐ的两个片段，证实该扩增片段即为ＥＢＶ特生ＤＮＡ酶的全基因片段。     

猴免疫缺陷病毒SIV核心蛋白基因在大肠杆菌中表达的研究

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ），直接从ＳＩＶ感染的猴艾滋病（ＳＡＩＤＳ）模型猴的外周血淋巴细胞总ＤＮＡ中扩增出７６７ｂｐ的ＳＩＶ核心蛋白Ｐ２７基因片段。扩增产物经ＥｃｏＲＩ及ＳａｌＩ双酶切后，克隆入相同酶切的表达质粒ｐＢＶ２２０中，获得含ＳＩＶ核心蛋白基因片段的重组质粒ｐＢＶＳＧ，并进行ＤＮＡ序列分析。用该重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ经筛选、增殖及４２℃温度诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明外源基因表达蛋白含量占菌体总蛋白１４．５％，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实表达产物能被ＳＩＶＰ２７单克隆抗体及ＳＡＩＤＳ模型猴血清中特异性抗体识别。     

PCR—谱酶法检测小儿肝炎综合征人疱疹解毒DNA的研究

为探讨婴儿肝炎综合征（ＮＨＳ）与疱疹病毒（ＨＳＶ）感染的关系。在疱疹病毒高度同源序列ＤＮＡ聚合酶基因中设计一对引物，能对ＨＳＶ－Ｉ、ＨＳＶ－Ⅱ、ＥＢＶ和ＣＭＶ四种疱疹病毒ＤＮＡ进行扩增，继而用凝胶电泳和限制性内切酶ＢａｍＨⅠ或ＳｍａⅠ酶切分析扩增产物进行鉴别，建立了能一次性分型检测上述四种病毒的ＰＣＲ－酶谱法。灵敏度可测到１ｆｇＤＮＡ，且该引物仅对四种疱疹病毒扩增。用建立的ＰＣＲ－酶谱法检测３０例     

HCV5’－NCR序列克隆和转录重组质粒构建

选取ＩＶ基因型ＨＣＶ及中国和台湾代表株ＨＣＶ的５’ＮＣＲ区保守序列合成引物，以ＲＴ－ＰＣＲ从输血后非甲非乙型肝炎病人血浆中扩增一段３００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段作目的基因，钝端插入ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ切点，构建了ｐＵＨＣＶ－ＮＣ重组质粒。对ｐＵＨＣＶ－ＮＣ分别或混合应用ＨＣＶ序列特异的内外引物和载体序列特异的通用引物进行ＰＣＲ扩增，所用产物分子量均同预期相符；酶切分析查出ＨＣＶ基因所带有和克隆位点融合所产生的两个外源ＮｃｏＩ切点也存在；证实ｐＵＨＣＶ－ＮＣ中克隆基因是ＨＣＶ的５’ＮＣＲ序列且插入方向为反向。应用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双切出克隆ＨＣＶ基因，粘端插入ｐＳＰ７２的多克隆位点，均建了ｐＳＨＣＶ－ＮＣ转录重组体，对之进行了ＰＣＲ和酶切鉴定。     

2.2.15细胞中HBV DNA前C和C区PCR扩增及其产物测序

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及其扩增产物的直接测序技术对２．２．１５细胞中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因前Ｃ和Ｃ区进行测序。结果表明，根据ａｙｗ亚型ＨＢＶ基因设计的引物能够扩增２．２．１５细胞中ＨＢＶＤＮＡ扩增产物位于２２１－２９８碱基对之间，而对ａｄｒ亚型ＨＢＶＤＮＡ无扩增作用，说明ＰＣＲ扩增是特异性的，所测到的１３２个碱基序列与ａｗｙ１亚型ＨＢＶＤＮＡ完全符合，提示２．２．１５细胞中ＨＢＶＤＮＡ属ａ     

病毒与人类基因组同源性初探

探讨病毒与人类基因组同源性问题。选用ＥＢ病毒（ＥＢＶ），肠道病毒（ＥＶｓ）、单纯疱疹病毒－１型（ＨＳＶ－１），丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）特异性引物，以６份健康成人外周血ＤＮＡ为模板，分别进行聚合酶链式反应（ＰＣＲ）。初步结果表明：有５份ＤＮＡ样品可通过ＥＢＶ、ＨＣＶ特异性引物扩增。ＥＢＶ引物扩增后的片段大小在１５４～２３４ｂｐ之间；ＨＣＶ引物扩增后的片段大小约２００ｂｐ和１２０ｂｐ。提示病毒某些基因可能存在人类基因组中或两者具有很高的同源性。     

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因在真核表达载体中的亚克隆

目的 将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因片段克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶＫ ,以便以进行酸疫苗的研究。方法 特定核苷酸引物的设计和合成,ＴＲＩＺＯＬ试剂以日本血吸虫成虫ＲＮＡ〈ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ基因编码序列,将扩增产物连接ＰＧＥＭ－Ｔ克降体,再亚克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶ中。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出ＳｊＧＳＴ编码基因片段。其大小约为６７０ｂｐ,经双酶切、ＰＣＲ鉴定表明所构     

催乳素调控序列荧光素酶报告基因的构建

目的通过将人催乳素(hPRL)启动子上游的调控基因(包括启动子,-3518 bp~+15 bp)插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中,构建成含催乳素调控序列的荧光素酶报告基因(PRL3400-pGL3-Basic),用于催乳素在淋巴细胞中的表达调控研究。方法将含hPRL启动子的PGEM-PRL3400,及荧光素酶报告基因pGL3-Basic转染大肠肝菌(JM109)后扩增,提取并纯化PGEM-PRL3400和pGL3-Basic;分别以SacⅠ、BamHI酶切PGEM-PRL3400,SacⅠ、BglⅡ酶切pGL3-Basic;电泳并回收PRL3400片段和pGL3-Basic酶切大片段,在T4 DNA连接酶的作用下,将PRL3400片段插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中。结果通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒含有pGL3-Basic全序列及催乳素启动子上游调控序列,并且PRL3400片段调控序列的插入位置与方向正确。结论该荧光素酶报告基因构建成功。     

在西安地区HBeAg阴性患者中检出乙型肝炎病毒前C区基因突变株

作用ＨＢｅＡｇ阴性，抗ＨＢｅ阳性患血清提取ＨＢＶ ＤＮＡ作为模板，用前Ｃ区引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ），选择３份ＰＣＲ扩增阳性产物，用ＥｃｏＲＩ酶切获得长为３１２ｂｐ的基因片段。将其克至ＰＵＣ１８质粒中，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，提取质粒，经ＰＣＲ扩增及酶切鉴定后，用双脱氧末端标记法进行基因序列测定。结果发现，在２例患ＨＢＶ ＤＮＡ克隆中存在有前Ｃ区基因突变，即１８９６位的鸟嘌呤为腺嘌呤...     

一种简单、稳定、可靠的屏氧酶1基因多态性分析法

目的：建立一种简单、稳定、可靠的PON1基因多态性分析法。方法：取外周静脉血100μl，用ROSE法提取基因组DNA，用两对引物：P192F 5′-TAT TGT TGC TGT GGG ACC TGA G-3′,P192R 5′-CAC GCT AAA CCC AAA TAC ATC TC-3′；P55F 5′-GAA GAG TGA TGT ATA GCC CCA G-3′,P55R 5′-TTT AAT CCA GAG CTA ATG AAA GCC-3分别进行PCR扩增，用限制性内切酶AlwI,NlaⅢ对两种PCR产物分别进行酶切，3％琼脂糖凝胶电泳。结果：扩增的两个PCR产物在192、55多态性位点大小分别为99bp、170bp。Alw I酶切后，凝胶电脉得到完全酶切（66bp,33bp)，部分酶切（99bp、66bp、33bp)，未被酶切（99bp)三种类型DNA片段（RR，QR，QQ基因型）；NlaⅢ酶切后，凝胶电脉得到部分酶切（170bp,126bp,44bp)，未被酶切（170bp)两种类型DNA片段（LM，LL基因型）。经双盲重复检测，结果一致。应用此方法对胃癌患者血样标本检测，发现其PON1基因多态性在192位点频率较高。结论：采用一步PCR－RFLP技术可以建立简单、稳定、可靠的PON1基因多态性分析法。     

Adr亚型HBV中蛋白基因的T载体克隆及序列分析

构建含适当限制酶切位点的ａｄｒ 亚型乙肝病毒（ＨＢＶ） 中蛋白基因克隆,比较分析序列变化,用作ＨＢＶ 疫苗表达及诊断试剂的研究。患者血清经蛋白酶Ｋ 消化,再以酚 氯仿抽提,对提取物进行ＰＣＲ 扩增。回收ＰＣＲ 阳性产物,经琼脂糖酶消化后直接克隆至Ｔ 载体。转化后提取质粒经ＰＣＲ 及酶切鉴定,再行序列分析。结果：１０ 份血清提取物的ＰＣＲ 有３ 份获阳性产物,分别经Ｔ 载体克隆后转化ＤＨ１０ｂ 菌,３ 株阳性克隆经酶切及序列分析显示同属于ａｄｒ 亚型,与国内已发表序列的同源性大于９９ ．６ ％ 。提示该克隆是用作ＨＢｓＡｇ 蛋白表达或探针标记研究的理想克隆。     

错配PCR限制片段长度多态性分析：检测HBV前C区A＿（83）点突变

为建立一种简易的检测ＨＢＶ前Ｃ区Ａ８３点突变的方法，设计了一种针对Ａ８３变异株的错配引物，通过ＰＣＲ，可在Ａ８３变异株的扩增产物中引入一个ＢＳＵ３６Ｉ限制酶位点，将扩增产物（１０２ｂｐ）用该酶消化，含变异者显示８２ｂｐ的酶切片段，以此判定的变异与测序结果一致。用本法检测了慢性乙型肝炎１２例和随访ＨＢｅ血清转换者５例，结果表明前Ｃ区Ａ８３变异与病变发展一致。     

人血小板反应素-1活性片段的克隆与序列分析

目的　为研究抗肿瘤基因工程药物的表达奠定基础。方法　根据 Genbank中人血小板反应素 - 1(TSP- 1) m RNA序列 ,设计和合成了两对特异引物 ,利用逆转录聚合酶反应扩增出人 TSP- 1中的两个活性片段 ,大小分别为 72 8bp和 2 5 7bp,分别命名为 TSP- 1- 和 TSP- 1- 。将此片段纯化后插入 PMDT载体。结果　限制酶切分析表明 :这两个片段已插入载体中 ,其大小与预期值相符。序列分析显示 :TSP- 1- 长 72 8bp,编码的多肽长2 12个氨基酸残基 ,推测其相对分子质量为 2 3.6× 10 3;TSP- 1- 长 2 5 7bp,编码的多肽长 86个氨基酸残基 ,推测其相对分子质量为 9.5× 10 3。结论　同源性分析表明 :TSP- 1- 和 TSP- 1- 与 Genbank中的 TSP- 1序列完全相同     

Mispairing PCR－RFLP：a simple method to detect A_（83） point mutation in HBV preC region

ＭｉｓｐａｉｒｉｎｇＰＣＲ－ＲＦＬＰ：ａｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｃｔ　Ａ_（８３）ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＨＢＶｐｒｅＣｒｅｇｉｏｎＹａｎｇＪｉｅ（杨洁）；ＬｉａｎｇＺｈｉｓｅｎ（梁炽森）；ＬｕｏＫａｎｇｘｉａｎ（骆抗先）（Ｄｅｐ?..     

HBV X基因真核表达载体的构建研究

目的：构建HBVX基因与pCDNA3．1相融合的高效真核表达载体，为进一步研究HBVX基因的功能奠定基础。方法：设计并合成HBVX基因的引物，从HBVDNA阳性的血清中，PCR扩增得到HBVX基因全序列，将其连接到真核表达载体pCDNA3．1上后，酶切图谱分析PCR检测和扩增产物序列分析等，鉴定所构建的真核表达载体。结果：以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同，酶切也得到目的基因片段，测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论：成功构建了HBVX基因的真核表达载体，为下一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达的载体构建及鉴定

目的:构建HBV X基因与pCDNA3.1相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础。方法:设计并合成HBV X基因的引物,以HBV DNA阳性血清PCR扩增得到HBV X基因全序列;将X基因连接到真核表达载体pCDNA3.1上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论:成功构建了HBV X基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。