人晚期糖基化终产物受体胞质内段融合蛋白表达载体的构建与表达

目的构建人晚期糖基化终产物受体胞质内段(hRAGE-C)GST融合蛋白的重组原核基因表达载体并进行表达与纯化,研究其功能并鉴定与其相互作用的蛋白。方法采用PCR方法扩增hRAGE基因编码区的胞质内段,并将其重组于pGEX-KG载体中。重组质粒经PCR、酶切、序列鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21,以异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导产生hRAGE胞质内段的GST融合蛋白。结果PCR、酶切和测序结果表明所克隆的GST/hRAGE-C原核表达载体完全正确,继而表达、纯化获得了相对分子质量约35 000的融合蛋白(符合预期大小)。结论将hRAGE胞质内段构建于含有GST标记的载体上并获得融合蛋白的高效表达。     

人可溶性晚期糖基化终产物受体的原核表达及活性鉴定

目的构建人可溶性晚期糖基化终产物受体(hsRAGE)His融合蛋白表达载体并在原核细胞表达与纯化。方法PCR扩增hRAGE基因编码区的胞质外段，利用分子克隆技术将其重组于pET-14b载体中。利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性转化大肠杆菌BL21(DE)3，用异丙基b—D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达。以尿素对获得的包涵体进行处理，用金属螯合亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性。以Western印迹和ELISA法对融合蛋白的免疫原性及与AGE的结合活性进行鉴定。结果克隆的hsRAGE完全正确．经过表达与纯化．获得了相对分子质量约45000的融合蛋白。纯化得到的变性蛋白经复性后可被相应抗体识别。所得到的hsRAGE具有与AGE相互结合的活性，并能够抑制AGE绣导的内皮细胞NF-κB的表达．结论成功地构建了hsRAGE融合蛋白原核表达载体且获得高效表达．得到大量的复性蛋白；该蛋白具有特异的免疫原性，保持与AGE的结合活性．并能够有效阻断AGE-RAGE相互作用。     

人可溶性晚期糖基化终产物受体的原核表达及活性鉴定

目的构建人可溶性晚期糖基化终产物受体(hsRAGE)His融合蛋白表达载体并在原核细胞表达与纯化。方法PCR扩增hRAGE基因编码区的胞质外段,利用分子克隆技术将其重组于pET-14b载体中。利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性。转化大肠杆菌BL21(DE)3,用异丙基b-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达。以尿素对获得的包涵体进行处理,用金属螯合亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性。以Western印迹和ELISA法对融合蛋白的免疫原性及与AGE的结合活性进行鉴定。结果克隆的hsRAGE完全正确,经过表达与纯化,获得了相对分子质量约45000的融合蛋白。纯化得到的变性蛋白经复性后可被相应抗体识别。所得到的hsRAGE具有与AGE相互结合的活性,并能够抑制AGE诱导的内皮细胞NF-kB的表达。结论成功地构建了hsRAGE融合蛋白原核表达载体且获得高效表达,得到大量的复性蛋白;该蛋白具有特异的免疫原性,保持与AGE的结合活性,并能够有效阻断AGE-RAGE相互作用。     

晚期糖基化终产物受体、可溶性晚期糖基化终产物受体与2型糖尿病心血管并发症的关系

晚期糖基化终产物受体(RAGE)是细胞表面分子免疫球蛋白超家族受体成员之一,作为一种细胞信号转导受体,与多种配体结合后,激活多种细胞信号转导通路,引起氧化应激和炎症反应等,参与动脉粥样硬化的形成,与2型糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病密切相关;可溶性RAGE是游离的RAGE胞外段,可与RAGE配体竞争性的结合,抑制RAGE介导的信号传递,拮抗配体-RAGE轴过度活化所致的生物学效应,起保护作用。     

晚期糖基化终产物受体在糖尿病足患者中的表达特征

目的:研究晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)在糖尿病足患者中的蛋白表达水平.方法:按照病例入选标准收集25例糖尿病足患者,21例单纯糖尿病患者,以及20例非糖尿病手术患者,用 ELISA 检测血清 RAGE 表达,取各组患者足部皮肤组织标本,用Western blot检测组织中 RAGE蛋白的表达.结果:RAGE在正常血清、单纯糖尿病患者血清、糖尿病足患者血清及足部皮肤组织中均有表达;糖尿病足患者血清中 RAGE 表达( 313.34 ± 24.36) ng /L 明显高于正常对照组( 59.14 ± 23.71) ng /L及单纯糖尿病组( 86.47 ± 29.35) ng /L.糖尿病足患者足部皮肤组织中RAGE蛋白表达亦明显高于单纯糖尿病患者组及正常对照组,两组间差异有统计学意义( P ＜ 0.05).结论:RAGE 在糖尿病足患者中表达明显升高;RAGE可能与糖尿病足的发生、发展有密切关系;RAGE 可能成为一个新的糖尿病足治疗靶点,对于糖尿病足的临床治疗有积极意义.     

脑缺血后晚期糖基化终产物受体(RAGE)的表达

目的通过人脑梗死组织标本,研究脑缺血后晚期糖基化终产物受体(RAGE)的表达情况。方法根据缺血时间,将人脑梗死组织标本切片,分为梗死<2 d组2、~5 d组和>5 d组。应用免疫组化法检测人脑组织标本中糖基化终产物受体(RAGE)的表达情况。结果免疫组化结果显示,各组人脑梗死组织切片中单位视野内患侧RAGE阳性细胞数与健侧比较均有极显著差异(P<0.01),其患侧和健侧阳性细胞数均随病程延长而增加。结论RAGE参与脑缺血损伤过程,RAGE的表达随着损伤时间的延长而增加,其表达可能与细胞凋亡有关。     

晚期糖基化终产物受体在心房颤动患者血清中的表达及意义

目的探讨心房颤动（AF）患者血清高迁移率族蛋白1（HMGB1）、晚期糖基化终产物内源性分泌受体（es-RAGE）及晚期糖基化终产物C端短截受体（cRAGE）水平的变化。方法本研究收集我院连续入院的75例AF患者,另外纳入32例年龄和性别与AF组相匹配的健康查体者作为对照组。采用ELISA法检测两组人群血清HMGB1、cRAGE及esRAGE水平。结果阵发性AF组及持续性AF组HMGB1水平高于对照组（均P〈0.05）;持续性AF组HMGB1水平高于阵发性AF组（P〈0.05）。阵发性AF组及持续性AF组cRAGE水平高于对照组（均P〈0.05）;持续性AF组cRAGE水平高于阵发性AF组（P〈0.05）。阵发性AF组及持续性AF组esRAGE水平低于对照组（均P〈0.05）;持续性AF组esRAGE水平低于阵发性AF组（P〈0.05）。结论本研究显示持续性和阵发性AF患者血清HMGB1和cRAGE水平显著升高,而esRAGE水平显著降低,提示cRAGE和esRAGE可能成为AF的两种新型生物标记物,且可能与HMGB1共同参与了AF发生的病理生理过程。     

抗人晚期糖基化终产物受体胞外段不同表位单克隆抗体的制备

目的 制备抗人晚期糖基化终产物受体(RAGE)胞外段单克隆抗体。方法 用纯化人重组RAGE胞外段(氨基酸序列23～342)免疫Balb／c小鼠，取其脾细胞与NS—1融合制备杂交瘤，经筛选和两次克隆化，从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果和结论 获得两株杂交瘤细胞B2．2和E10，其分泌单抗的亚型均为IgG2b。经ELISA、Westernblot和流式细胞仪鉴定，证明两株单抗均可结合重组RAGE及表达于细胞表面的RAGE，且两株抗体识别的位点为远隔表位，所建立的双夹心法可用于检测可溶性重组RAGE。这两株抗体将为研究RAGE相关疾病提供有效的工具。     

晚期糖基化终产物引起内皮细胞connexin43表达上调

目的研究晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)对体外培养的人脐静脉内皮细胞缝隙连接蛋白(gap junction protein)connexin43基因表达的影响。方法 D-葡萄糖孵育牛血清白蛋白制备糖基化牛血清白蛋白作为晚期糖基化终产物。体外常规培养的人脐静脉内皮细胞分为4组,分别为对照组,100、200和400mg/L AGEs干预组,干预24h后通过RT-PCR方法检测各组connexin43基因mRNA的表达有无差别;通过免疫荧光方法检测对照组和200mg/L AGEs干预组之间connexin43蛋白的表达水平有无差别。结果不同浓度(100、200、400mg/L)的AGEs干预24h均能引起人脐静脉内皮细胞con-nexin43基因mRNA的表达上调(P<0.01);200mg/L的AGEs干预24h引起人脐静脉内皮细胞connexin43基因的蛋白表达上调(P<0.01)。结论 AGEs体外短期干预可引起人脐静脉内皮细胞connexin43基因的mRNA和蛋白表达水平上调。     

晚期糖基化终末产物受体不同突变体真核表达载体的构建和表达

目的 构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体(RAGE)不同突变体的真核细胞表达载体.方法 采用定点突变技术将亚克隆在载体pcDNA3-HA上的野生型RAGE构建成不同突变体pcDNA3-HA-RAGE(S391A)、pcDNA3-HA-RAGE(S399A)、pcDNA3-HA-RAGE(S400A)、pcDNA3-HA-RAGE(T401A),经测序鉴定正确后转染HEK293细胞,利用Western blotting检测各突变体的表达.结果 RAGE不同突变体经测序鉴定正确无误后.在HEK293细胞中得到高量表达.结论 成功构建了RAGE不同突变体的真核表达载体,并在真核细胞中进行了表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导中的作用奠定了基础.     

解聚复肾宁对糖尿病大鼠血清AGEs和肾RAGE表达的影响

目的:探讨解聚复肾宁(JieJufushenning,JJFSN)对糖尿病(Diabetes mellitus,DM)大鼠血清晚期糖基化终产物(Advancedglycation end products,AGEs)和肾脏晚期糖基化终产物受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)表达的作用.方法:建立链脲佐菌素(Streptozotoein,STZ)诱导的sD大鼠DM模型,将成模DM大鼠随机分为4组:DM模型组(B组),JJFSN组(c组),氨基胍(Aminoguanidine,AG)组(D组),JJFSN AG组(E组),另设正常对照组(A组).采用相应干预措施处理12周.常规方法测定12周末各组大鼠血糖、肾功、24h尿蛋白定量(24hPro)和尿肌酐;荧光分光光度法测定血清AGEs水平;免疫组化法测定肾脏RAGE表达.结果:C组、D组和E组大鼠血糖、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、24hPro定量明显低于B组,但高于A组;尿肌酐明显高于B组(P＜0.05),但低于A组;c组、D组和E组血清AGEs水平和肾脏RAGE表达水平均明显低于B组,其中D组低于C组,以E组最低,但仍高于A组.结论:JJFSN具有AG类似作用,可抑制蛋白质非酶糖基化反应,减少血清AGEs牛成和肾脏RAGE表达;并具有降低血糖、24hPro、BUN、Scr的作用;联合使用JJFSN和AG比各自单独使用作用更明显.     

内源性可溶性糖化终末产物受体和内源性分泌型糖化终末产物受体水平对糖尿病性骨质疏松症的诊断价值

目的探讨内源性可溶性糖化终末产物受体(sRAGE)和内源性分泌型糖化终末产物受体(esRAGE)对糖尿病性骨质疏松症的诊断价值。方法 59例≥50岁髋部骨折住院患者分为非糖尿病组(Ⅰ组,20例)、糖尿病非骨质疏松症组(Ⅱ组,21例)及糖尿病合并骨质疏松症组(Ⅲ组,18例),用双能X线骨密度仪检测骨密度(BMD),酶联免疫吸附测定法检测血浆sRAGE、esRAGE水平,并检测空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、肌酐(Cr)、碱性磷酸酶(AKP)、钙(Ca)等生物化学指标及体质量指数(BMI)。结果 3组患者的BMI、Cr、TG、TC、AKP水平差异均无统计学意义(P>0.05),Ⅰ组和Ⅱ组患者血浆Ca水平比较差异无统计学意义(P>0.05),但与Ⅲ组Ca水平比较差异均有统计学意义(P<0.01);3组间血浆FBG、HbA1c、BMD、sRAGE、esRAGE水平比较差异均有统计学意义(P<0.01);sRAGE、esRAGE水平与FBG、HbA1c呈负相关(P<0.01),与BMD呈正相关(P<0.01)。结论血浆sRAGE、esRAGE可能成为糖尿病性骨质疏松症的诊断指标。     

可溶性晚期糖基化终末产物受体及其基因多态性与2型糖尿病的易感性分析

目的 探讨可溶性晚期糖基化终末产物受体(sRAGE)水平及晚期糖基化终末产物受体(RAGE)基因单核苷酸位点多态性与2型糖尿病的关联。方法 选择184例2型糖尿病患者作为糖尿病组,190例健康体检者作为正常对照组。ELISA方法检测sRAGE水平,PCR-TaqMan-MGB探针检测rs2070600、rs1800624、rs1800625及rs184003基因分型。结果 糖尿病组sRAGE水平[M(P₂₅,P₇₅)]为1087.4(713.5,1213.4)pg/mL,正常对照组sRAGE为908.2(674.6,1107.1)pg/mL,两组差异有统计学意义(P<0.001)。糖尿病组与正常对照组间4个位点的最小等位基因频率分布均无统计学差异,且在基因型分析中也无阳性发现。线性相关分析表明,4个位点与sRAGE水平均无明显关联性。结论 sRAGE水平与2型糖尿病的发病相关,但RAGE位点多态性与糖尿病无明显关联。RAGE位点多态性与sRAGE水平无关联。     

糖基化终产物对人单核细胞EMMPRIN基因表达的影响

目的:探讨糖基化终产物(AGEs)对人单核细胞细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)表达的影响。方法:在培养的人单核细胞株中分别加入不同浓度AGEs干预24h和同一浓度AGEs干预不同的时间点,以1640培养基和相应浓度的牛血清白蛋白为对照组。用逆转录聚合酶链反应检测EMMPRIN mRNA的表达水平。结果:AGEs干预人单核细胞的EMMPRIN mRNA水平与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);且其表达呈时间和浓度依赖性降低(P<0.05)。结论:AGEs以时间及浓度依赖的方式减少人单核细胞EMMPRIN mRNA的表达。     

人Api6融合蛋白原核表达系统的构建

目的:本研究拟采用蛋白原核表达的方法,诱导表达人Api6(Apoptosis inhibitor 6)融合蛋白,为进一步研究Api6在凋亡抑制、脂质代谢和肿瘤发生中的作用奠定基础.方法:利用PCR技术扩增人Api6基因,将其克隆至原核表达载体ppSUMO,构建重组质粒ppSUMO-Api6;重组质粒转化原核表达宿主菌E...     

抗人晚期糖基化终产物受体胞外段不同表位单克隆抗体的制备

目的 制备抗人晚期糖基化终产物受体(RAGE)胞外段单克隆抗体。方法 用纯化人重组RAGE胞外段(氨基酸序列23~342)免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与NS-1融合制备杂交瘤,经筛选和两次克隆化,从制备的腹水中纯化单克隆抗体。结果和结论 获得两株杂交瘤细胞B2.2和E10,其分泌单抗的亚型均为IgG2b。经ELISA、Western blot和流式细胞仪鉴定,证明两株单抗均可结合重组RAGE及表达于细胞表面的RAGE,且两株抗体识别的位点为远隔表位,所建立的双夹心法可用于检测可溶性重组RAGE。这两株抗体将为研究RAGE相关疾病提供有效的工具。     

异氟醚对大鼠认知功能及海马高级糖基化终末产物受体表达的影响

目的 观察异氟醚对大鼠海马高级糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)表达及认知功能的影响.方法 SD雄性老年大鼠(24月龄)45只,SD雄性成年大鼠(4月龄)45只,随机数字表法分为6组(n=15),老年对照组(C1组),成年对照组(C2组):吸入30%氧气的空氧混合气体对照;老年异氟醚单次吸入组(S1组),成年异氟醚单次吸入组(S2组):1.5%异氟醚单次吸入2h;老年异氟醚多次吸入组(R1组),成年异氟醚多次吸入组(R2组):1.5%异氟醚吸入3次,1次/d,2h/次.各组大鼠吸入处理后1d取8只行Morris水迷宫进行认知功能测试,其余大鼠处死取海马,RT-PCR方法测定RAGE mRNA水平,免疫组织化学方法测定RAGE蛋白表达.结果 各组大鼠吸入处理过程中生命体征平稳,血氧饱和度及心率均在正常范围.C1组穿越平台次数为(7.30±2.40)次,探索时间为(49.90±6.22)s,S1、R1组与C1组相比穿越平台的次数减少[穿越平台次数分别为S1(3.90±2.42),R1(3.44±2.40),F=7.448,P<0.01],探索时间缩短[探索时间分别为S1(43.33±7.08)s,R1(39.09±4.56)s,F=7.63,P<0.05],而逃避潜伏期延长(P<0.05).R2组较C2组逃逸潜伏期延长[逃逸潜伏期分别为R2(14.65±3.83)s,C2(7.84±2.51)s,F=12.773,P<0.01],探索时间缩短(均P<0.01),穿越平台次数减少(P<0.01).S2组与C2组比较,空间探索时间与穿越平台次数均未见显著统计学差异(P>0.05);RAGE表达:与C1组比较S1、R1组mRNA表达水平增高[mRNA表达分别为c1(0.11±0.02),S1(0.56±0.09),R1(0.73±0.14)F=169.447,P<0.01],免疫组化阳性细胞颗粒数增多(P<0.01),S1组与R1组比较蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与C2组比较,S2组mRNA水平及蛋白表达未见明显差异(P>0.05),但R2组mRNA及免疫组化阳性细胞表达增高,与C2组比较差异有显著意义(均P<0.01).结论 异氟醚导致不同月龄大鼠认知功能改变,尤其对老年大鼠影响显著,可能与海马RAGE表达上调有关.