黄素化颗粒细胞分离提纯方法的比较研究

目的比较不同人卵巢颗粒细胞分离提纯方法的效果。方法收集体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者取卵后的卵泡液,分别采用密度梯度离心法、红细胞裂解法、密度梯度离心法+红细胞裂解法分离、提取黄素化颗粒细胞,比较3种方法获取的细胞数量、存活率、纯度以及生长、贴壁情况。结果密度梯度离心法获取的颗粒细胞数量最低,但体外培养生长状态良好且细胞贴壁状态最佳;红细胞裂解法获取的颗粒细胞数量均多于其他两种方法(P0.05),但细胞存活率低,体外培养生长状态欠佳、细胞贴壁差;卵泡刺激素受体(FSHR)细胞免疫组化及荧光鉴定显示3种方法获取的颗粒细胞纯度均90%。结论密度梯度离心法获取的细胞数目少,但生长状态及贴壁情况最佳,是分离提纯颗粒细胞较为理想的选择方法。     

新型肝癌组织的体外三维培养模型

目的:利用肝癌组织进行体外的三维（three-dimension，3D）组织块培养，通过添加PD98059和霍乱毒素（cholera toxin，CT）优化培养条件，建立一种高活性的肝癌组织体外培养模型。方法:收集中山大学肿瘤防治中心肝胆科的肝癌组织标本，经清洗、冻存、复苏等处理后分为对照组、PD组、CT组、PD+CT组，同时进行体外的二维（two-dimension，2D）和三维培养。各组组织采用DNA断裂的原位末端标记法（TUNEL）检测组织细胞凋亡情况，qRT-PCR检测BCL-2、BID、Caspase 3、Cyclin D1、CDK2、ELK-1、C-FOS、C-MYC、C-JUN等相关基因的mRNA表达水平，免疫荧光染色检测BCL-2和cleaved caspase-3蛋白表达情况，筛选并确定最优的体外培养方法。结果:3D培养组的组织细胞凋亡均少于2D培养组；PD98059通过上调BCL-2蛋白的表达，下调cleaved caspase-3蛋白的表达，激活MEK/ERK下游基因，从而减少体外培养的组织细胞凋亡，增强其抗凋亡能力；霍乱毒素通过上调Cyclin D1、CDK2的基因表达，促进其增殖。结论:我们开发了一种新型肝癌组织的体外三维培养模型，它可以作为进一步的药物试验和人源性异种移植(PDX)模型的工具。     

大鼠骨髓间充质干细胞培养鉴定及复方扶芳藤合剂含药血清对细胞增殖的影响

目的:建立SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养方法,观察不同浓度的复方扶芳藤合剂大鼠含药血清对大鼠BMSCs增殖的影响。方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化BMSCs,对其进行细胞形态学观察,将BMSCs进行成骨、成脂定向诱导分化,采用流式细胞仪检测其表面标志物,分析其细胞周期,进行BMSCs鉴定;采用不同浓度(20%、10%和5%)的复方扶芳藤合剂含药血清和空白血清连续7 d对大鼠BM SCs进行干预,以CCK-8法检测其吸光度值,对比各组细胞生长情况。结果:BMSCs具有典型的成纤维样细胞形态,集落生长呈漩涡状。BMSCs成脂、成骨诱导后,油红O染色和茜素红染色均呈阳性。第3代BMSCs表型CD29、CD44、CD34、CD44表达分别为99.645%、99.677%、0.016%、0.133%;不同浓度的复方扶芳藤合剂含药血清和空白血清连续干预7 d后,CCK-8法检测显示:20%浓度的复方扶芳藤合剂含药血清组,其1~7 d的吸光度均值均高于20%浓度的空白血清组(P<0.05);10%的含药血清组的吸光度均值在3~7 d,高于10%的空白血清组(P<0.05);5%的含药血清组与5%的空白血清组比较无明显差异(P>0.05)。结论:全骨髓贴壁法分离、培养BM SCs,操作简单,方法稳定,可大量扩增BMSCs。扩增后的BMSCs具有间充质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能。复方扶芳藤合剂含药血清干预后的BMSCs增殖能力增强,其中20%浓度的复方扶芳藤合剂含药血清在本实验中为最佳干预浓度。     

皮肤角朊细胞的三维培养

<正>表皮角朊细胞(keratinocyte,KC)是皮肤创伤后"再上皮化"过程中的主要功能细胞,其增殖和移行是创缘皮肤早期修复的重要生物学过程[1,2]。在体内外环境下探索和检测各种分子类药物、纳米颗粒材料等对KC增殖、移行和分化的功效以及创伤后组织结构和功能的快速修复,是微创治疗的热点研究内容之一[3]。KC的培养作为开展相关研究工作的前提,因其在体外环境贴壁性差,细胞活力低,增     

新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞纯化及培养方法的改进

目的快速纯化大鼠大脑皮质原代星形胶质细胞并进行传代培养。方法取新生2日龄SD大鼠大脑皮层,每2只为一组,将剥除软脑膜的大脑皮层剪碎,添加0. 25%胰蛋白酶-EDTA溶液500μL,37℃消化15 min,将细胞悬液接种于未用多聚赖氨酸处理过的培养瓶中,37℃、5%CO_2细胞培养箱中孵育15 min后,将细胞以5×10~6个/m L接种于L-多聚赖氨酸包被的T75培养瓶中。待细胞长满瓶底,200 r/min 37℃恒温摇18 h,加入1 m L 0. 25%胰蛋白酶,待大部分细胞悬浮后收集细胞。在倒置相差显微镜下对细胞进行形态学观察,胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色法进行星形胶质细胞纯度鉴定,并以MTS法测定传代后细胞增殖活力。结果星形胶质细胞纯度达到(97. 86±0. 91)%,细胞传代后生长情况及增殖活力良好。结论该方法可以高效获取原代及传代的大鼠大脑皮质星形胶质细胞。     

自噬在高糖条件下视网膜色素上皮细胞表达血管内皮生长因子促进RF/6A细胞血管生成中的作用

目的　研究高糖条件下诱导的人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19）自噬对其表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），及恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）迁移和管腔形成的影响。方法　根据不同干预将ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组及3-甲基腺嘌呤（3-MA）+高糖组。对照组细胞在无糖DMEM培养基中常规培养24 h，高糖组细胞在DMEM培养基中加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h，3-MA+高糖组细胞先用10 mmol·L^-1 3-MA处理24 h，然后更换培养基再加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h。Western blot法检测细胞自噬标志性蛋白微管相关蛋白1 轻链 3（microtubule-related protein 1 light chain 3，LC3）II型和I型的比值(LC3-II/LC3-I)、Beclin-1及细胞中自噬相关基因3（autophagy-related gene 3，Atg3）的蛋白表达。ELISA法检测ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达。比较三组ARPE-19细胞LC3-II/LC3-I、Beclin-1、Atg3及VEGF的蛋白表达量。然后将以上三组ARPE-19细胞上清液分别加入RF/6A细胞培养基中，将RF/6A细胞也按以上方法分组，分别采用Transwell法及Matrigel胶法检测并比较三组RF/6A细胞迁移数及细胞管腔形成数。结果　对照组、高糖组和3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比值分别为0.405±0.095、0.932±0.024和0.635±0.048；Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.205±0.035、0.590±0.120和0.425±0.082；Atg3蛋白相对表达量分别为0.277±0.035、0.539±0.071和0.389±0.019。ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达量三组分别为（44.03±9.08）ng·L^-1、（205.70±17.90）ng·L^-1和（112.52±21.06）ng·L^-1；RF/6A细胞迁移数三组分别为（125.60±6.35）个、（153.60±19.20）个和（67.40±7.95）个；细胞管腔形成数三组分别为（12.22±0.84）个、（18.44±1.68）个和（5.44±0.51）个；整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与对照组相比，高糖组ARPE-19细胞的LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1及Atg3蛋白相对表达量均明显增加（均为P<0.01），VEGF表达水平均明显升高（P<0.01），RF/6A细胞迁移数和管腔形成数均明显增加（均为P<0.01），3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/I比值、Beclin-1和Atg3蛋白相对表达量、VEGF表达量、RF/6A细胞迁移数和细胞管腔形成数均较高糖组明显降低（均为P<0.01）。结论　高糖激活ARPE-19细胞自噬，进而上调VEGF的表达并促进RF/6A细胞迁移和管腔形成，自噬抑制剂3-MA可抑制ARPE-19细胞自噬，并下调VEGF的表达从而抑制RF/6A细胞的血管形成能力。     

新生大鼠原代小胶质细胞分离培养方法的改良

目的研究改良体外小胶质细胞分离培养的方法及效果。传统法存在动物用量大、成本高且细胞培养时间长等局限。方法结合消化试剂组合和手摇震荡法培养分离小胶质细胞;同时采用Iba-1免疫荧光法进行细胞鉴定和纯度分析,台盼蓝染料法进行活力检测以及脂多糖刺激比较不同状态的小胶质细胞。结果改良法可在4 d内稳定获得小胶质细胞 1. 0×10~6个/60 mm培养皿,纯度≥98%,活力 98%,较传统法在动物用量、总成本和培养时间分别减少了2、3. 2、1. 5倍。结论改良法可减少动物用量、降低成本,缩短细胞培养时间;为研究小胶质细胞的生物学功能和中枢神经系统疾病机制建立了一种稳定、简便、高效的细胞模型。     

ICSI联合IVM技术在卵巢低反应高龄患者中的应用

目的：探讨胞浆内单精子注射（ICSI）联合未成熟卵母细胞体外成熟（IVM）技术在卵巢低反应高龄患者中的应用价值。方法：回顾性分析2016年1月—2018年9月于郑州大学第一附属医院生殖医学中心行ICSI助孕治疗81个周期，年龄≥35岁，获卵数≤3个，且卵母细胞均未成熟。按促排卵方案分为微刺激方案组（n=37）和拮抗剂方案组（n=44），统计2组患者基础情况、实验室结果及妊娠结局。结果：①2组患者年龄、不孕时间、基础内分泌、基础窦卵泡数及抗苗勒管激素（AMH）比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；②拮抗剂方案组Gn总量较微刺激方案组高，差异有统计学意义（P＜0.05）；③微刺激方案组与拮抗剂方案组体外培养成熟率、2PN率、卵裂率、可利用胚胎率及优胚率比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；④微刺激方案组与拮抗剂方案组的胚胎存活率、种植率和临床妊娠率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：对于卵巢低反应的高龄患者行ICSI联合IVM培养有利于提高卵母细胞成熟率及胚胎利用率，增加妊娠机会，微刺激方案Gn用量少对卵巢低反应患者是经济有效的选择。