分离猪颗粒细胞和内泡膜细胞的改良法

分离猪颗粒细胞和内泡膜细胞的改良法吴尔若，袁冬，宗书东参考Ｍｏｒａｇ等［１］分离内泡膜细胞（Ｔ－Ｃ）的方法，加以改良后能同时获得纯净的颗粒细胞（Ｇ－Ｑ）和内泡膜细胞，满足体外双池培养Ｇ－Ｃ和Ｔ－Ｃ的需要。一、材料和方法１．试剂：ＭｃＣｏｙ′ｓ５ａ培养...     

原代培养大鼠颌下腺细胞分离方法的比较研究

目的 探讨体外培养大鼠颌下腺细胞的分离方法并进行比较。方法 取Wistar大鼠颌下腺分别采用直接分离法与胰酶消化法分离获取颌下腺细胞，并进行原代及传代培养；相差倒置显微镜观察细胞形态，苔盼蓝染色法测细胞成活率，MTT法检测培养细胞活性，并检测24、48、72和96小时不同时间培养上清液中淀粉酶的含量，免疫组织化学鉴定细胞来源及比例。结果 直接分离法获取的细胞活性为70％，活力值为0．16土0．014，功能欠佳，经胰酶消化法所获取的细胞活性为85％，活力值为0．45土0．013，细胞形态完整、贴壁良好，且功能强；免疫组织化学校测颌下腺细胞α—SMA抗体、CK8．13抗体、keratin抗体呈阳性反应，胰酶消化法顿下腺细胞反应强度大于直接分离法。结论 胰酶消化分离获取颌下腺细胞的方法优于直接分离法。     

小鼠肝星状细胞的分离、培养及鉴定方法

目的：探索BALB／c小鼠肝星状细胞（HSCs）分离、纯化的可行方案．并评价依该法分离所得HSCs的生物学特性。方法：经肝门静脉先用不含钙镁离子的Hank液充分灌洗,再以浓度为1mg／mL的Ⅳ型胶原酶灌注BALB／c小鼠肝脏。取肝后．完整分离后碾碎,37℃水浴振荡30min,Percoll连续密度梯度（60％）离心法分离、纯化HSCs．苔盼蓝染色检测HSCs活性,结蛋白免疫细胞化学鉴定HSCs,光镜观察体外培养HSCs的形态学变化。结果：纯化后每只小鼠HSCs收获量约为（5．5±0．4）×10^5个．HSCs纯度〉90％．HSCs细胞活率〉90％。结论：本实验建立的的分离纯化方案可获得高纯度高活率的小鼠HSCs。     

大鼠肝细胞、Kupffer和Ito细胞的分离与培养

我们采用Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ体内门静脉灌注结合体外Ｔｒｙｐｓｉｎ皿内消化制备游离肝细胞，进而采用ＰｒｏｎａｓｅＥ和Ｎｙｃｏｃｌｅｎｚ离心处理获单－Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞和Ｉｔｏ细胞。三种细胞的产生率分别为１．２×１０８，１．１×１０７和２．３×１０７；其细胞纯度分别为９５％，８１％和８８％；存活率都在９０％以上。作者对三种细胞原代培养过程的形态特征和生物学活性进行了观察与讨论。     

多囊卵巢综合征患者卵巢黄素化颗粒细胞瘦素信号转导分子STAT3磷酸化表达的研究

目的检测多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢黄素化颗粒细胞瘦素信号转导子和活化子STAT3磷酸化(p-STAT3)水平,并观察瘦素体外对培养卵巢黄素化颗粒细胞p-STAT3水平的影响,探讨瘦素在PCOS发病机制中的作用。方法选择行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的肥胖型PCOS患者(肥胖PCOS组)、非肥胖型PCOS患者(非肥胖PCOS组)、排卵功能正常和单纯输卵管因素不育的肥胖(肥胖对照组)及正常体重妇女(正常对照组)各15例。采用免疫印迹技术检测卵巢黄素化颗粒细胞p-STAT3水平。同时将正常人卵巢黄素化颗粒细胞行体外培养,分别加入不同浓度的瘦素(0、10、100、1,000 ng/ml)培养48 h,观察瘦素体外对人卵巢黄素化颗粒细胞p-STAT3水平的影响。结果(1)肥胖型PCOS组、肥胖对照组、非肥胖PCOS组和正常对照组卵巢黄素化颗粒细胞p-STAT3水平分别为(24.28±0.51)、(21.31±1.32)、(11.69±0.67)、(9.03±0.20),实验组间比较有显著性差异(P<0.05),其中肥胖型PCOS组p-STAT3表达水平最高,其次依次为肥胖对照组、非肥胖PCOS组和正常对照组。各组之间两两比较,均有显著性差异(P<0.05)。(2)加入瘦素培养48 h后,卵巢黄素化颗粒细胞p-STAT3水平随瘦素浓度升高而增高,呈浓度依赖性,至瘦素浓度达到100 ng/ml时,p-STAT3水平达到高峰,随后呈下降趋势。结论瘦素通过介导JAK2/STAT3信号途径可能参与了肥胖型PCOS的发病机制。     

人卵巢黄素化颗粒细胞细胞周期蛋白D2的表达与卵巢功能及反应性的相关性研究

目的探讨人卵巢黄素化颗粒细胞细胞周期蛋白D2（cyclin D2）的表达与卵巢功能及超排卵过程中卵巢反应性的相关性。方法收集48例行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）患者的卵巢黄素化颗粒细胞,根据取卵时卵泡发育数不同将卵巢反应性分为高反应组（12例）、中反应组（30例）及低反应组（6例）。采用免疫细胞化学方法检测颗粒细胞膜上eyclin D2及增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测颗粒细胞cyclin D2 mRNA的表达水平;化学发光法测定基础血清卵泡刺激素（FSH）,人绒毛膜促性腺激素（hCG）日E2水平。分析颗粒细胞eyelin D2 mRNA及蛋白的表达与IVF临床各项参数、卵巢反应性的关系以及和颗粒细胞增殖活性PCNA标记指数（PCNA-LI）的相关性。结果（1）黄素化颗粒细胞cyclinD2蛋白表达与年龄、基础FSH水平及促性腺激素（Gn）支数呈负相关（r=-0．547,P〈0．01;r=-0．456,P〈0．05;r=-0．451,P〈0．05）;cyclinD2蛋白表达与获卵数和hCG日E2水平呈正相关（r=0．592,P〈0．01;r=0．626,P〈0．01）;高、中和低反应三组cyclinD2蛋白表达有显著统计学差异（F=4．995,P〈0．05）。（2）黄素化颗粒细胞cyclin D2 mRNA表达与年龄、基础FSH水平呈负相关（r=-0．510,P〈0．05;r=-0．891,P〈O．01）;与获卵数和hCG日E2水平呈正相关（r=0．629,P〈0．01;r=0．524,P〈0．05）;高、中和低反应三组cyclin D2 mRNA的表达有显著统计学差异CF=8．843,P〈0．01）。（3）黄素化颗粒细胞cyclin D2蛋白及mRNA表达与PCNA-LI均呈显著正相关（r=0．696,P〈0．01;r=0．498,P〈0．0S）。结论黄素化颗粒细胞cyclin D2 mRNA及蛋白的表达可反映卵巢储备功能并与卵巢反应性正相关。cyclin D2可能通过调节颗粒细胞的增殖分化参与卵泡的发育。     

多种酶消化法分离培养气管上皮细胞方法的比较

目的比较4种不同的酶消化法在培养气管上皮细胞中的异同,改进气管上皮细胞的培养技术,为组织工程气管提供理论种子细胞。方法Dispase冷消化法(使用0.1%Dispase4℃消化18h后使用0.25%的胰酶37℃消化10min)、胰酶冷消化法(0.25%胰酶4℃消化18h)、Dispase温消化法(0.25%Dispase37℃消化10min后使用0.25%胰酶37℃消化5min)及胰酶温消化法(0.25%的胰酶37℃消化10min),用4种消化法分离、培养兔气管上皮细胞,测定分离细胞的数量、纯度及成活率。结果4种方法所得细胞数量分别为:(430600.00±628.49、430780.00±580.52、430900.00±200.00、430640.00±931.67),差异无统计学意义(P<0.05)。Dispase冷消化法较其他3种方法得到的气管上皮细胞纯度高,细胞状态好。结论Dispase冷消化法较其他3种方法所得细胞纯度高、细胞成活率高,是一种较好的气管上皮细胞体外分离培养方法。     

三种小胶质细胞原代培养方法的比较

目的 探讨建立简捷高效原代小胶质细胞纯化培养方法 .方法 以小胶质细胞原代培养McCarthy经典培养方法 为基础,分为常规对照组、机械分离组、胰酶消化组和利多卡因组共四组培养,并对比观察记录形态变化并计数,借助CD68及OX42抗体间接免疫荧光标记进行鉴定、计算纯度.结果 三种分离方法 均获得了较高纯度和产量的小胶质细胞,以利多卡因组为佳,纯度为(94.92±7.05)%,流式细胞结果 显示细胞纯度约为(96.2±2.8)%.结论 小胶质原代细胞培养过程中,采用利多卡因处理可显著提高细胞分离效率及纯度.     

卵母细胞发育潜能与颗粒细胞凋亡关系的初步研究

目的　探讨卵母细胞发育潜能与颗粒细胞凋亡之间的关系。　方法　将卵母细胞在体外培养 28~30 h后,取其颗粒细胞,采用TUNEL法进行凋亡率的分析,并与卵子的成熟情况和卵子的评分及形成胚胎结果进行对照。　结果　经培养后,随着卵母细胞成熟度的降低,凋亡率升高;而且随着卵母细胞评分和发育潜能的降低,颗粒细胞凋亡率逐渐升高。　结论　卵子发育潜能与颗粒细胞凋亡密切相关,通过测定颗粒细胞的凋亡率可预测未成熟卵母细胞的发育潜能。     

三种组织块法培养人牙周膜细胞的比较研究

目的提高人牙周膜细胞(Human periodontal ligament cells,HPDLCs)原代培养的成功率,并缩短培养周期。方法以高血清培养基组织块法、传统组织块法和玻片覆盖组织块法等3种方法原代培养HPDLCs。通过镜下观察细胞形态,免疫组化方法鉴定细胞来源,及绘制细胞生长曲线等方面,对各种方法的成功率进行比较。结果 3种方法所培养的原代细胞均生长良好,呈梭形,波形丝蛋白和碱性磷酸酶染色阳性、角蛋白染色阴性,符合HPDLCs的形态和生物学特征。高血清培养基组织块法的原代培养的成功率为84.21%,明显高于其他2种方法 (P0.01)。结论高血清培养基组织块法能显著提高HPDLCs原代培养的成功率。     

人卵巢颗粒细胞体外分离培养后连续传代的观察

目的 观察两种方法分离的人卵巢颗粒细胞(GCs)体外培养后的连续传代情况.方法 选取行辅助生殖技术治疗的不孕患者,收集促排卵后穿刺取卵获得的卵泡液(FF),分别用密度梯度离心法和红细胞裂解法分离人GCs,进行体外培养、扩增及连续传代,并用免疫荧光法对原代及传代后GCs进行鉴定.结果 红细胞裂解法获得的GCs数量较密度梯...     

分离肝细胞纯化培养方法的比较研究

目的 评价一种可提高肝细胞纯度和存活率的分离培养方法。方法 以体外两步胶原酶灌流法分离肝细胞,然后将其分成两组,对照组在接种培养前不经进一步处理,试验组则在应用适宜的Percoll梯度液离心纯化之后再行培养。藉台盼蓝拒染法比较两组肝细胞的存活率,采用MTT法动态比较两组肝细胞的增殖状态,在相差显微镜下观察细胞的纯度和形态。结果 未经进一步纯化处理的猪肝细胞存活率为90％±5％,鼠肝细胞存活率为80％±5％,两者纯度均约90％;经Percoll梯度液离心纯化后,其高活力肝细胞比率均提高至98％±2％,纯度可达99％以上。从开始接种到大部分肝细胞贴壁生长,试验组比对照组肝细胞的时间有所缩短。结论 用Percoll梯度液纯化新分离肝细胞,可提高肝实质细胞的活力与纯度。     

几种小鼠胰岛的分离纯化方法比较

目的探讨几种小鼠胰岛的分离纯化方法及进行纯化后胰岛的计数和完整性的分析。方法选用ICR小鼠,采用不同胶原酶消化方法和不同的胶原酶种类,并用Ficoll-PaqueTMPLUS密度梯度离心法对胰岛进行纯化,并对获得的胰岛进行DTZ染色计数和计算当量,扫描电镜考察胰岛的完整性。结果采用胶原酶V和P胰管灌注、内外消化结合,消化需时较短,胶原酶V和P在胰岛纯化前后每只小鼠收获的胰岛细胞数量和当量无差别(P>0.05);扫描电镜结果显示消化较好的胰岛表面被膜完整,消化过度的胰岛导致被膜不完整,易致外层细胞损伤。结论小鼠逆行胰管灌注胶原酶、内外消化相结合的胰岛消化方法所需时间较短,但同时要注意防止消化过度。     

不同促排卵方案对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

目的研究不同促排卵方案对小鼠卵巢颗粒细胞Fas凋亡通路的影响。方法将雌性KM小鼠随机分为4组:孕马血清促排卵组(PMSG组)、促性腺激素释放激素激动剂组(GnRH-a组)、促性腺激素释放激素拮抗剂组(GnRH-ant组)、自然排卵组(空白对照组),每组10只。取排卵期卵巢组织,采用免疫组化检测卵巢组织凋亡因子Fas、FasL、Caspase8、Caspase3的表达情况。结果 4组小鼠卵巢颗粒细胞均有Fas、FasL、Caspase8、Caspase3的表达;经不同促排卵方案干预后,小鼠卵巢颗粒细胞免疫组化Fas、FasL、Caspase8、Caspase3表达水平总体趋势为:GnRH-a组/GnRH-ant组空白对照组PMSG组。其中,PMSG组小鼠卵巢颗粒细胞Fas、FasL、Caspase8、Caspase3表达低于空白对照组,但差异无统计学意义(P0.05);GnRH-a组与GnRH-ant组小鼠卵巢颗粒细胞Fas、FasL、Caspase8、Caspase3表达显著高于空白对照组(P0.05)。结论不同促排卵方案对小鼠卵巢颗粒细胞Fas凋亡通路的影响不同,PMSG方案可能抑制颗粒细胞凋亡,GnRH-a方案与GnRH-ant方案可能促进颗粒细胞凋亡。     

Effects of leptin and neuropeptide Y on function of human ovarian granulosa cells in vitro

Objective: To investigate the effects of leptin and neuropeptide Y on steroidogenesis of human ovarian granulosa cells in vitro. Methods: Human ovarian granulosa cells were isolated from follicular fluid obtained during oocyte retrieval of in vitro fertilization-embryo transfer program and cultured for 2 days with various concentration of leptin(1,10,100 ng/ml) or neuropeptide Y (1×10-6, 1×10-7, 1×10-8 mol/L) alone or both,or with the combination of human chorionic gonadotropin (hCG 0, 20 IU/L). The medium was collected for estradiol (E2) and progesterone (P) measurements. Results: (1)Whether hCG existed or not, the adding of leptin did not alter estradiol and progesterone production by human granulosa cells (P>0.05).(2) Only when the concentration of neuropeptide Y was at 1×10-7mol/L,estradiol level was lower than that in the control (P<0.05).(3) The levels of estradiol in neuropeptide Y (1×10-7mol/L) plus hCG group were significantly higher than those with neuropeptide Y alone(P<0.05). (4) In the absence of hCG, the levels of estradiol in neuropeptide Y (1×10-7mol/L)plus leptin (10 ng/ml) group were significantly higher than those with neuropeptide Y(1×10-7mol/L)alone(P<0.05).Conclusions: (1)Leptin alone produced no direct effect on secretion of E2 and P from granulosa cells in vitro.(2)Neuropeptide Y alone may inhibit the secretion of E2, but the inhibition would probably be blocked with the presentation of hCG.(3)Leptin probably blocked the inhibition of neuropeptide Y on E2 secretion, and this may indicate that there were some coordination between leptin and neuropeptid Y on the level of ovarian function.     

瘦素、神经肽Y对离体人卵巢颗粒细胞分泌功能的影响

目的　探讨瘦素、神经肽Y(NPY)对离体人卵巢颗粒细胞雌、孕激素生成的影响。　方法　将来自体外受精 胚胎移植的 2 5例离体人卵巢颗粒细胞纯化后 ,在不同浓度瘦素 (1、10、10 0 μg/L)、NPY(1× 10 -8、1× 10 -7、1× 10 -6mol/L)单独或与人绒毛膜促性腺激素 (hCG ,0、2 0IU/L)联合作用下体外培养 ,采用放射免疫方法测定培养液中雌二醇 (E2 )、孕酮(P)的水平。　结果　 (1)无论单独或与hCG联合不同浓度瘦素组E2 、P水平均无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;(2 )NPY浓度 1× 10 -7mol/L时 ,E2 水平显著低于空白对照组 (P <0 .0 5 ) ,但与hCG联合组显著高于单独组 (P <0 .0 5 ) ;(3)NPY浓度 1× 10 -7mol/L、瘦素浓度 10 μg/L组 ,E2 水平明显高于相应浓度NPY单独作用组 (P <0 .0 5 )。　结论　 (1)瘦素不直接影响体外培养颗粒细胞E2 、P的分泌 ,可能通过影响其它因子的作用而间接调节卵巢功能 ;(2 )NPY单独作用时 ,对颗粒细胞E2 的分泌有一定抑制作用 ,但当hCG存在时作用消失 ,说明在正常月经周期中NPY对黄体的生成和维持可能无明显不利影响 ;(3)瘦素可能阻断NPY对颗粒细胞分泌E2 的抑制作用 ,表明二者可能对卵巢功能有相互协调作用。     

兔骨髓间充质干细胞分离方法的比较

目的：建立并优化骨髓间充质干细胞分离纯化的方法。方法：从兔的胫骨中抽取骨髓，分别通过直接培养、经Fichu—Hypeque和Perool两种分离介质进行分离后再培养的方法，收获所培养的细胞，然后测量间充质干细胞所占的比例。结果:直接培养、经Fichu—Hypaque、Perool分离后再培养的细胞中，骨髓间充质干细胞比例分别为67．3％、83．6％、93．4％。结论:采用Perool分离方法可以更好的提高MSCs的纯度，提高MSCs的培养效率。     

兔骨髓间充质干细胞分离方法的比较

目的建立并优化骨髓间充质干细胞分离纯化的方法.方法从兔的胫骨中抽取骨髓,分别通过直接培养、经Ficoll-Hypaque和Percol两种分离介质进行分离后再培养的方法,收获所培养的细胞,然后测量间充质干细胞所占的比例.结果直接培养、经Ficoll-Hypaque、Percol分离后再培养的细胞中,骨髓间充质干细胞比例分别为67.3%、83.6%、93.4%.结论采用Percol分离方法可以更好的提高MSCs的纯度,提高MSCs的培养效率.