联合应用胰岛素样生长因子-Ⅰ和骨形成蛋白-2促小鼠成骨样细胞及成纤维细胞增殖和分化的效应

目的探讨重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ(rhGF-Ⅰ)和重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)单独及联合应用对MC 3T3-E1和NIH 3T3细胞增殖和分化的影响.方法单独或联合应用不同浓度rhIGF-Ⅰ和rhBMP-2作用于MC 3T3-E1和NIH 3T3细胞后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞分化情况,放射免疫法检测细胞分泌的骨钙素(OC)水平.结果 1～75 ng/ml rhIGF-Ⅰ与10～100ng/ml rhBMP-2作用于MC 3T3-E1和NIH 3T3细胞后,均能显示明显的促细胞增殖(P＜0.01)及使ALP活性增高(P＜0.05)的作用.各浓度rhIGF-Ⅰ或rhBMP-2对MC 3T3-E1及NIH3T3细胞作用8、24和48h的MTT检测结果相似.rhIGF-Ⅰ和rhBMP-2联合作用后,对两种细胞的促增殖、增强ALP活性的作用均较各自单独作用更为明显(P＜0.05).单独或联合应用不同浓度rhIGF-Ⅰ和rhBMP-2对细胞分泌的OC水平均无显著影响(P＞0.05).结论 rhIGF-Ⅰ和rhBMP-2具有明显的促细胞增殖及早期分化的协同作用,但对成骨末期细胞分化影响不大,其活性主要与使用剂量有关.     

多平面重建联合容积再现重建对肺小结节早期诊断的价值研究

目的 探索多平面重建（MPR）联合容积再现重建（VR）对肺小结节（直径≤1.0cm）的早期诊断价值。方法 回顾性分析159例患者经手术病理确诊肺小结节的术前CT薄层扫描（TSCT）、MPR和VR图像表现,采用ROC曲线比较分析MPR联合VR与TSCT诊断肺小结节的灵敏度、特异度和正确率,并对阅片医师与病理金标准的一致性及阅片医师之间的一致性进行分析评价。结果在毛刺征、分叶征、血管集束征以及胸膜牵拉征的显示上,MPR联合VR均优于TSCT,差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）。3位阅片医师（A、B、C）采用MPR联合VR诊断的灵敏度和正确率均明显优于采用TSCT,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,而特异度差异均无统计学意义（均P＞0.05）;MPR联合VR诊断结果与病理金标准的一致性（A：κ=0.773,B：κ=0.754,C：κ=0.783）以及阅片医师之间的一致性（A和B：κ=0.743,B和C：κ=0.789,A和C：κ=0.751）均优于TSCT。结论MPR联合VR能显著提高对直径≤1.0cm肺小结节早期诊断效能。     

引起儿童呼吸道感染的优势肠道病毒及其血清型和流行特征分析

目的 了解近年杭州地区引起儿童呼吸道感染的优势肠道病毒(EVs)及其血清型以及流行特征和易感人群。方法 收集2016-2018年本地区2 164例发热伴呼吸道感染症状患儿咽拭标本,采用EVs通用引物的实时荧光定量RT-PCR检测EVs核酸,阳性标本采用EVs VP1/VP2基因通用引物的套式PCR扩增后测序分型。分析患儿性别、年龄、感染的优势EVs及其血清型等流行病学特征。结果 2 164 例患儿咽拭子标本中有508 例(23.5%)EVs核酸阳性,其中290 例成功测序分型。检出的EVs中,柯萨奇病毒A 组(CoxA)和B 组(CoxB)分别占75.2%和11.7%、EV71占8.9%、埃可病毒(Echo)占4.1%,CoxA检出率高于CoxB、EV71和埃可病毒(P<0.05)。在检出的CoxA中,CoxA6(39.5%)和CoxA10(33.0%)检出率高于CoxA16、CoxA4和CoxA2(P<0.05)。1~3 岁男性儿童是EVs易感人群(P<0.05),其中男性儿童易感CoxA6、女性儿童易感CoxA10(P<0.05)。结论 EVs是本地区儿童呼吸道感染的重要病原体,柯萨奇病毒及其CoxA6和CoxA10分别是优势EVs和血清型,1~3 岁儿童是本地区EVs主要易感人群,男性比女性更易感。     

问号钩端螺旋体fliN基因原核表达及其产物的鉴定

目的克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株鞭毛相关基因fliN并构建其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性。方法提取钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长fliN基因片断,T-A克隆后测序。按常规方法构建fliN基因原核表达系统,并用IPTG诱导目的重组蛋白rFliN表达。采用SDS-PAGE结合Bio-Rad凝胶图象分析系统检测rFliN表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rFliN。采用兔抗问号钩体黄疸出血群赖株全菌抗血清的Western blot鉴定rFliN及其免疫反应性。结果与报道的相应序列比较,所克隆的fliN基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%。IPTG诱导原核表达系统pET32a-fliN-E.coliBL21DE3的rFliN表达量约占细菌总蛋白的30%,rFliN提纯后仅见单一的蛋白条带。rF-liN能与抗血清发生免疫结合反应。结论本研究成功地构建了高效表达目的重组蛋白的问号钩体fliN基因原核表达系统,RFliN有良好的免疫反应性,为深入研究FliN致病及免疫保护作用奠定了基础。     

经皮加压钢板系统和倒置微创内固定系统置入治疗老年股骨转子间骨折的半年随访

背景：近年来以股骨近端髓内钉、防旋股骨近端髓内钉为代表的髓内固定系统治疗股骨转子间骨折报道较多,但两者比较分析的研究较少。目的：探讨经皮加压钢板和倒置微创内固定两种治疗股骨转子间骨折的临床效果。方法：经皮加压钢板置入21例,倒置微创系统置入15例,年龄65~91岁。观察置入后并发症及髋关节功能Harris评分。结果与结论：全部获得随访6个月,髋关节功能经皮加压钢板组优良率87%,倒置微创内固定组87%。两组患者并发症少,没有患者发生钢板螺钉松动断裂、深静脉血栓形成、髋内翻。提示对于使用髓内固定系统有困难的老年股骨转子间骨折,用此两种微创髓外固定系统也可达到理想的治疗效果。     

经皮加压钢板系统和倒置微创内固定系统置入治疗老年股骨转子间骨折的半年随访

背景：近年来以股骨近端髓内钉、防旋股骨近端髓内钉为代表的髓内固定系统治疗股骨转子间骨折报道较多,但两者比较分析的研究较少。 目的：探讨经皮加压钢板和倒置微创内固定两种治疗股骨转子间骨折的临床效果。 方法：经皮加压钢板置入21例,倒置微创系统置入15例,年龄65~91岁。观察置入后并发症及髋关节功能Harris评分。 结果与结论：全部获得随访6个月,髋关节功能经皮加压钢板组优良率87%,倒置微创内固定组87%。两组患者并发症少,没有患者发生钢板螺钉松动断裂、深静脉血栓形成、髋内翻。提示对于使用髓内固定系统有困难的老年股骨转子间骨折,用此两种微创髓外固定系统也可达到理想的治疗效果。     

问号钩端螺旋体MazF蛋白对巨噬细胞的毒性作用分析

目的了解问号钩端螺旋体（简称钩体） MazEF毒素-抗毒素系统中MazF蛋白对巨噬细胞的细胞毒性及其机制。方法采用原核表达系统表达问号钩体赖型赖株MazEF毒素-抗毒素系统中的MazE和MazF蛋白（ rMazE和rMazF ）。采用DNA和RNA降解试验确定rMazF的DNA或RNA酶活性以及rMazE抑制rMazF酶活性的作用。采用实时荧光定量RT-PCT、Western blot 和激光共聚焦显微镜法,分别检测问号钩体赖株感染THP-1单核细胞时mazE和mazF基因转录、表达及分泌情况。采用CCK-8法和流式细胞术检测mazF基因产物对THP-1细胞的细胞毒性及死亡方式。结果 rMazF能水解问号钩体赖株和 THP-1细胞的RNA,但无DNA酶活性, rMazE 能抑制rMazF的RNA酶活性。感染THP-1细胞后,mazE-mRNA和mazF-mRNA及MazE和MazF蛋白表达水平显著升高,但仅有MazF蛋白外分泌。 mazF 基因产物对 THP-1细胞有细胞毒性并引起细胞坏死。结论MazEF毒素-抗毒素系统中具有RNA酶活性的MazF蛋白是问号钩体的毒力因子,可引起感染的巨噬细胞坏死。     

问号钩端螺旋体经线粒体相关信号通路诱导巨噬细胞凋亡的研究

目的 确定线粒体相关信号转导途径在问号钩端螺旋体(简称钩体)诱导小鼠单核-巨噬细胞凋亡过程中的作用.方法 建立问号钩体黄疸出血群赖株诱导小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1凋亡模型.采用透射电镜观察感染细胞线粒体病变情况,JC-1染色法检测感染细胞线粒体膜电位变化,荧光探针DCFH-DA检测感染细胞内活性氧(ROS)水平.采用试剂盒检测感染细胞caspase-8和caspage-9活性变化.流式细胞术检测感染细胞凋亡情况以及cagpage阻断剂阻断凋亡的效果.采用Western blot检测线粒体内和胞质中的细胞色素c(cytc)以及凋亡诱导因子(Air)、核酸内切酶G(EndoG)和Smac水平.应用免疫荧光染色法检测AIF和EndoG从细胞质至核内的转位.结果 问号钩体赖株可诱导J774A.1细胞凋亡.感染细胞的线粒体有明显病变,线粒体膜电位降低且胞内活性氧水平升高.感染细胞caspage-8活化,caspase-9则否,但caspase阻断剂不能完全阻断细胞凋亡.感染细胞AIF和EndoG从线粒体释放至胞质并转位至细胞核内.未检测到感染细胞胞质内CytC水平升高及Smac的释放.结论 线粒体可通过非caspase途径的AIF和EndoG参与问号钩体诱导单核一巨噬细胞凋亡的过程.     

空肠弯曲菌mcp1/2/3基因原核表达及其产物与细菌趋化作用的相关性

目的 克隆空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)接受甲基趋化蛋白(MCP)编码基因mcp1、mcp2和mcp3并构建其原核表达系统,建立空肠弯曲菌体外趋化模型并确定趋化诱导物质,了解MCPs与趋化诱导物之间的关系.方法 PCR扩增mcp1、mcp2和mcp3基因片段,T-A克隆后测序.构建上述目的 基因原核表达系统,SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶成像分析系统检查目的 重组蛋白rMCP1、rMCP2和rMCP3的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rMCPs.rMCPs免疫家兔获得抗血清,免疫扩散法测其效价.用饱和硫酸铵盐析法和DEAE-32离子交换法提纯IgG,经胃蛋白酶酶解和Sephedex G-100层析制备IgGF(ab')2.建立HAP(hard-agar plus)法空肠弯曲菌体外趋化模型并检测8种物质的趋化诱导作用.采用基于IgG F(ab')2封闭的趋化阻断试验,确定不同MCPs的功能及其差异.结果 PCR扩增获得预期大小的mcp1、mcp2和mop3基因片段,其核苷酸和氨基酸序列与文献报道完全相同.所构建的原核表达系统能有效地表达各rMCPs,其产量均约为细菌总蛋白的10%.rMCP1、rMCP2和rMCP3免疫家兔后能产生特异性抗体,其免疫扩散效价均为1∶4.牛胆汁和脱氧胆酸钠(DOC)对空肠弯曲菌趋化有浓度依赖性诱导作用(P<0.05).MCP1和MCP2被其IgG F(ab')2 封闭后,空肠弯曲菌对DOC的趋化能力明显减弱(P<0.05),MCP3被封闭后对空肠弯曲菌趋化能力无影响(P>0.05).结论 本研究成功地表达了空肠弯曲菌MCPs蛋白.牛胆汁和DOC是诱导空肠弯曲菌趋化的信号物质,MCP1和MCP2可能参与该菌对DOC的趋化过程.