联合应用胰岛素样生长因子-I和骨形成蛋白-2促小鼠成骨样细胞及成纤维细胞增殖和分化的效应

目的探讨重组人胰岛素样生长因子-I(rhIGF-I)和重 组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)单独及联合应用对MC3T3-E1和NIH3T3细胞增殖和分化的影响。方法单独或联合应用不同浓度rhIGF-I 和rhBMP-2作用于MC3T3-E1和NIH3T3细胞后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞分化 情况,放射免疫法检测细胞分泌的骨钙素(OC)水平。结果1～75ng/mlrhIGF-I与10～100ng/mlrhBMP-2作用于MC3T3- E1和NIH3T3细胞后,均能显示明显的促细胞增殖(P<0.01)及使ALP活性增高(P<0.05)的作用。各浓度rhIGF-I或 rhBMP-2对MC3T3-E1及NIH3T3细胞作用8、24和48h的MTT检测结果相似。rhIGF-I和rhBMP-2联合作用后,对两种细胞 的促增殖、增强ALP活性的作用均较各自单独作用更为明显(P<0.05)。单独或联合应用不同浓度rhIGF-I和rhBMP-2对细胞分泌的 OC水平均无显著影响(P>0.05)。结论rhIGF-I和rhBMP-2具有明显的促细胞增殖及早期分化的协同作用,但对成骨末期细胞分化影响 不大,其活性主要与使用剂量有关。     

人重组骨形成蛋白-4与人重组胰岛素样生长因子-Ⅰ联合应用对大鼠成骨细胞的影响

目的探讨人重组骨形成蛋白-4(recombinant human bone morphogenetic protein-4,rhBMP-4)与人重组胰岛素样生长因子-Ⅰ(recombinant human insulin-like growth factor-Ⅰ,rhIGF-Ⅰ)联合应用对大鼠成骨细胞生长增殖及分化能力的影响。方法取大鼠颅盖骨组织块,采用改良组织块混合酶消化法培养成骨细胞,将第四代成骨细胞与10 ng/mL rhBMP-4(rhBMP-4组)、10 ng/mL rhIGF-Ⅰ(rhIGF-Ⅰ组)、10 ng/mL rhBMP-4加10ng/mLrhIGF-Ⅰ(联合组)、无血清低糖培养基(对照组)共同培养3 d,用噻唑蓝法测定细胞的增殖情况,用碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶的活性,用羟脯氨酸试剂盒检测成骨细胞分泌Ⅰ型胶原的量。结果第3天时,4组促进大鼠成骨细胞增殖能力测定的光密度值差异具有统计学意义(F=4.080,P=0.016),碱性磷酸酶活性差异具有统计学意义(F=4.070,P=0.016),成骨细胞分泌Ⅰ型胶原的差异具有统计学意义(F=3.204,P=0.038);与对照组相比,rhBMP-4组,rhIGF-Ⅰ组及联合组,都可增强成骨细胞的增殖分化能力,但rhBMP-4和rhIGF-Ⅰ联合应用不比单独应用的作用强。结论 rhBMP-4与rhIGF-Ⅰ联合应用,不能协同促进大鼠成骨细胞增殖及分化能力。     

TGF-β1促进rhBMP-2对成骨前体细胞增殖分化的观察

目的:观察TGF-β1对rhBMP-2促进成骨前体细胞(MC3T3-E1)增殖和分化能力的影响。方法:MC3T3-E1加入不同浓度的rhBMP-2和TGF-β1+rhBMP-2进行组织学观察,用MTT法检测细胞增殖,通过ELISA检测细胞ALP含量。结果:随着加入rhBMP-2浓度的增加,MC3T3-E1细胞的增殖逐渐增加,TGF-β1+rhBMP-2组增加更为显著(P<0.05)。TGF-β1+rhBMP-2组和rhBMP-2组在rhBMP-2浓度为25、50、100μg/L间存在统计学意义(P<0.05)。随着rhBMP-2浓度的增加,ALP值逐渐增加,TGF-β1+rhBMP-2组ALP值升高更为显著(P<0.01),TGF-β1+rhBMP-2组和rhBMP-2组在rhBMP-2浓度为25、50μg/L间有统计学意义(P<0.05)。结论:TGF-β1可促进rhBMP-2对MC3T3-E1的增殖和成骨分化作用。     

人重组骨形成蛋白-2诱导NIH3T3细胞向成骨细胞表型转化

目的探讨人重组骨形成蛋白一2 (rhBMP-2)对NU13T3成纤维细胞生物学行为的影响。方法培养 NIH3T3细胞，加人外源性rhBMP-2，用生长曲线、唾哇蓝(MIT)比色、流式细胞仪(FCM)分析、BrdU检测观察细胞的增殖和DNA合成，并检测碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OC)含量观察细胞是否有成骨趋向。结果加药组细胞的增殖活性下降、DNA合成变慢，All]活性和OC含量均增高。结论rhBMP-2使NIH3T3细胞增殖活性变弱，表现成骨细胞表型。     

rhBMP-2和IGF-I联合作用对兔成骨样细胞增殖的影响

目的研究人重组骨形成蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein,rhBMP),胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-I)单独及联合应用对兔成骨细胞增殖的影响.方法采用细胞培养技术及噻唑蓝比色法,对2种生长因子对兔成骨样细胞增殖的调节作用进行观察.结果在培养基中含1%胎牛血清(FBS)条件下,100ng/ml rhBMP-2对兔成骨样细胞增殖作用不显著.IGF-I(5,25,50ng/ml)有一定促增殖作用.两者联合应用各浓度组对细胞增殖有促进作用(P＜0.05).结论rhBMP-2和IGF-I联合应用对兔成骨样细胞增殖有协同效应.     

骨形成蛋白-2复制物与包被胶原的载体对成骨样细胞MC_3T_3-E_1细胞的作用

我们研究了人骨形成蛋白-2复制物(recombinant human bone morphogenetie protein-2,rhBMP-2)及其载体对MC3T3-E1细胞的作用。观察到使用羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)载体比玻璃或钛载体获得了较高的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase ALP)活性。当胶原被加入到HAP载体上时,ALP活性和DNA含量极其显著地增加。当细胞在包被胶原的HAP载体上培养而不是在HAP载体上时,rhBMP-2增加ALP活性。这些结果暗示rhBMP-2刺激MC3T3-E1细胞分化,以及包被胶原的HAP对BMP是很有用的载体。     

骨形成蛋白-2和碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的联合效应

目的 :了解重组人骨形成蛋白 - 2 (rhBMP - 2 )和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)单独和联合作用对人牙周膜细胞 (PDLC)碱性磷酸酶 (ALP)活性的影响。方法 :体外培养人PDLC ,分别用不同浓度的rhBMP- 2和bFGF单独或联合作用 ,用酶动力学方法检测PDLC的ALP活性。结果 :5 0～ 2 0 0 μg/L浓度的rhBMP - 2可显著增强人PDLC的ALP活性 (P <0 .0 1) ,而 10 μg/L浓度的bFGF可显著抑制人PDLC的ALP活性(P <0 .0 1) ,rhBMP - 2和bFGF联合作用仍可较明显地增强人PDLC的ALP活性 (P <0 .0 5 )。结论 :rhBMP - 2和bFGF联合应用可增强人PDLC的ALP活性     

rhBMP-4与rhIGF—Ⅰ联合应用对人牙周膜成纤维细胞增殖及分化能力的影响

目的:探讨rhBMP-4与rhIGF-Ⅰ联合应用对人牙周膜成纤维细胞增殖及分化能力的影响。方法:将人牙周膜成纤维细胞分别与10ng/ml rhBMP-4、10ng/ml rhIGF-Ⅰ、10ng/ml rhBMP-4 10ng/ml rhIGF-Ⅰ、无血清DMEM共同培养3d,用MTT法测定细胞增殖情况,用碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶的活性,用羟脯氨酸试剂盒检测细胞分泌Ⅰ型胶原的量。结果:第3天,10ng/ml rhBMP-4 10ng/ml rhIGF-Ⅰ组人牙周膜成纤维细胞的生长增殖能力最强,并与其它3组比较有显著性差异(P<0.05),但其增强细胞碱性磷酸酶的活性及促进细胞分泌Ⅰ型胶原的能力并不比两者单独作用强。结论:rhBMP-4与rhIGF-Ⅰ联合应用,能协同促进人牙周膜成纤维细胞增殖,但不能协同促进细胞分化。     

骨形成蛋白—2和碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的联合效应

目的了解重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2）和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单独和联合作用对人牙周膜细胞（PDLC）碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。方法体外培养人PDLC,分别用不同浓度的rhBMP-2和bFGF单独或联合作用,用酶动力学方法检测PDLC的ALP活性。结果50～200μg/L浓度的rhBMP-2可显著增强人PDLC的ALP活性（P<0.01）,而10μg/L浓度的bFGF可显著抑制人PDLC的ALP活性(P<0.01),rhBMP-2和bFGF联合作用仍可较明显地增强人PDLC的ALP活性（P<0.05）。结论rhBMP-2和bFGF联合应用可增强人PDLC的ALP活性。     

骨形成蛋白-2和碱性成纤维细胞生长因子对人骨髓基质细胞的生物学作用

目的：探讨重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(b—FGF)单独或联合作用对人骨髓基质细胞(HBMSC)增殖和分化的影响。方法：利用四唑盐比色法(MTT)、碱性磷酸酶(ALP)测定法观察不同浓度的rhBMP-2和b—FGF单独或联合作用时HBMSC的增殖和分化情况。结果：rhBMP-2对HBMSC的增殖和ALP表达均有促进作用；b—FGF促进HBMSC增殖，但抑制ALP表达；rhBMP-2和b—FGF联合作用时HBMSC的增殖和ALP活性较单独作用有显著提高。结论：rhBMP-2和b—FGF联合应用时对HBMSC的增殖和向成骨细胞分化具有协同作用。     

转化生长因子对成骨细胞增殖及其受体信号表达的影响

目的:研究转化生长因子βⅠ对小鼠成骨细胞增殖的调节作用,及其受体表达的变化,初步了解TGFβⅠ促成骨细胞增殖的分子机制.方法:以小鼠成骨细胞株MC3T3-E1为TGFβⅠ检测的细胞模型.10ng/ml TGFβⅠ作用MC3T3-E1细胞后,采用3H-TdR细胞增殖试验,检测成骨样细胞增殖改变,采用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TGFβⅠ,TGFβⅡ受体mRNA的表达.结果:(1)在10ng/mL浓度时,TGFβⅠ对MC3T3-E1细胞有明显的增殖促进作用,使MC3T3-E1成骨样细胞在24小时内成倍增殖.含转化生长因子组TGFβⅠ受体,TGFβⅡ受体的mRNA表达的水平高于空白对照组.(3)10ng/mLTGFβⅠ具有维持MC3T3-E1细胞活力的作用.(4)TGFβⅠ可能,通过MC3T3-E1细胞表面TGFβⅠ受体,TGFβⅡ受体途径表达,传递信号.     

突变受体阻断NIH3T3细胞中rhBMP-2诱导的信号转导

目的：探讨BMPsⅡ型突变受体对NIH3T3细胞BMPs信号转导的影响。方法：用携带BMPsⅡ型突变受体的cDNA的真核表达载体转染NIH3T3细胞，加入外源性rhBMP-2，用生K曲线、MTT比色、流式细胞仪分析、BrdU检测观察细胞是否有成骨趋向。结果：未转染细胞的增殖活性下降、DNA合成变慢，ALP活性和(OC)含量均增高；而转染细胞变化不明显。结论：rhBMP-2使木转染细胞增殖活性变弱，有成骨趋向；而转染细胞增殖活性变化小大，无成骨趋向。NIH3T3细胞中BMPs的信号转导做阻断了。     

非病毒载体介导pBMP-2转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化研究

目的 :探讨非病毒载体Gen Escort TM II介导质粒骨形态发生蛋白2(p BMP-2)转染对MC3T3-E1细胞增殖和体外成骨分化的影响。方法:以非病毒载体Gen Escort TM II介导报告基因质粒增强型绿色荧光蛋白(p EGFP)转染MC3T3-E1细胞,优化转染条件,荧光显微镜和流式细胞仪评价转染效率。p BMP-2转染MC3T3-E1细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,染色法检测碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)的表达,Real-time PCR分析成骨细胞标志基因ALP、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果 :Gen Escort TM II介导p EGFP转染MC3T3-E1细胞后,转染效率达35.02±4.42,MTT结果示基因转染对细胞增殖无影响(P>0.05)。p BMP-2转染组的ALP、ARS表达较p EGFP转染组和未转染组显著,同时Real-time PCR检测结果示,转染后6 d,p EGFP转染组和未转染组相比,p BMP-2转染组的成骨基因ALP、BSP、Runx2、OCN、OPN的表达量差异有显著性意义(P<0.05)。结论:非病毒载体Gen Escort TM II介导BMP-2转染MC3T3-E1细胞可诱导其向成骨方向分化。     

MicroRNA-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响

目的:探讨miR-103-3p对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化早期的影响。方法:以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为实验对象,对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导,分别在0、3、5、7 d应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测细胞中Runx2、Osx、ALP、miR-103-3p表达水平,Western免疫印迹（Western blotting）检测Runx2、Osx蛋白表达并进行碱性磷酸酶（ALP）染色。通过脂质体lipofectamine2000瞬时转染miR-103-3p模拟物 （miR-103-3p mimics）及模拟物阴性对照进入MC3T3-E1细胞内,Real-time PCR检测2组细胞miR-103-3p的表达水平,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。分别对2组细胞进行成骨诱导,在成骨诱导后0、3、7 d,分别使用Real-time PCR和Western免疫印迹检测2组细胞Runx2、Osx等成骨相关基因mRNA和蛋白的表达变化,并对2组细胞进行ALP染色。实验数据采用SPSS19.0软件包进行统计学分析。结果:MC3T3-E1经成骨诱导0、3、5、7 d后,细胞内Runx2、Osx、ALP转录水平持续显著升高;Runx2、Osx蛋白表达升高。ALP染色逐渐加深。在成骨诱导3、5、7 d的MC3T3-E1细胞中,miR-103-3p水平较诱导前受到持续显著抑制(P<0.05)。瞬时转染miR-103-3p mimics后,MC3T3-E1细胞中的miR-103-3p表达水平较对照组显著上调(P<0.05),细胞增殖受到抑制,Runx2、ALP转录水平显著抑制（P<0.05）,Runx2蛋白表达显著抑制。对转染后的细胞进行成骨诱导3、7 d后,miR-103-3p转染组细胞Runx2、Osx、ALP在转录水平的表达较对照组显著降低,Runx2、Osx在蛋白水平的表达较对照组显著降低,且miR-103-3p转染组细胞ALP活性较对照组显著降低。结论:miR-103-3p可能对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化早期起抑制作用。     

不同质量分数的钛-铜合金对MC3T3-E1细胞分化的影响研究

目的　探究不同质量分数的钛-铜合金对MC3T3-E1细胞分化的影响,并寻找促进细胞分化作用最佳的含铜质量分数。方法　将不同质量分数的钛-铜合金样片分组,设组1（cp Ti）为对照组,组2（Ti-2wt%Cu）、组3（Ti-5wt%Cu）、组4（Ti-10wt%Cu）为实验组。将MC3T3-E1细胞按2 × 104/孔的密度接种到包埋样片的24孔培养板中行共培养。在第3、5、10和15 d时,用微量酶标法检测成骨细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性表达情况;在第7、14和21 d时,分别用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测上清液中Ⅰ型胶原蛋白（COL-Ⅰ）、骨钙素（OC）活性表达情况。采用SPSS 20.0统计分析软件包对所有检测数据进行单因素方差分析,比较各组间差异。 结果　Ti-2wt%Cu最有利于ALP活性表达（P＜0.05）,共培养第10 d时达最大值;Ti-5wt%Cu最有利于COL-Ⅰ活性表达（P＜0.05）,共培养第7 d时达最大值;Ti-5wt%Cu最有利于OC活性表达（P＜0.05）,共培养第14 d时达最大值。 结论　与cp Ti相比较,低质量分数钛-铜（Ti-2wt%Cu、Ti-5wt%Cu）对MC3T3-E1细胞分化有促进作用,表现为时间依赖性;高质量分数钛-铜（Ti-10wt%Cu）对MC3T3-E1细胞分化有抑制作用。相对而言,Ti-5wt%Cu合金对MC3T3-E1细胞分化作用最佳。     

“壳-芯”结构电纺纤维膜对MC3T3-E1细胞体外早期成骨分化的影响

［摘要］　目的　研究载有骨形态发生蛋白(BMP-2)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)“壳芯结构”静电纺丝纤维膜(PP-B)对MC3T3-E1细胞体外早期成骨分化的影响。方法　通过同轴静电纺丝的方法制备PLGA/PCL-BMP-2纤维膜(PP-B),以不含BMP-2的PLGA/PCL电纺纤维膜(PP)为对照组。通过透射电子显微镜观察PP-B膜的“壳-芯”结构;用ELISA法检测BMP-2的体外释放行为;收集PP-B膜的浸出液培养细胞,用碱性磷酸酶(ALP)活性检测法检测其释放的BMP-2对MC3T3-E1细胞的影响;将MC3T3-E1细胞接种到纤维膜上,通过CCK-8法检测1d、3d、5d、7d的增殖情况;以碱性磷酸酶(ALP)活性为早期骨向分化指标,检测其7d的活性;用实时荧光定量逆转录PCR检测细胞接种7d时成骨指标Bmp2、Alp、Col1、Msx2、Runx2的表达。结果　透射电镜结果表明,同轴静电纺丝法制备的PP-B静电纺丝可形成连续均一的“壳-芯”结构;ELISA结果显示,PP-B膜可以实现BMP-2的持续释放;ALP活性检测结果证实本实验条件下制备的负载BMP-2的同轴静电纺丝支架能保持生长因子的部分活性。CCK-8结果显示PP-B膜和PP膜上的MC3T3-E1细胞在1、3、5、7d都持续增殖;ALP活性检测及染色结果显示PP-B膜上的MC3T3-E1细胞的ALP活性高于PP膜(P<0.05);实时荧光定量逆转录PCR结果显示接种在PP-B膜上的MC3T3-E1细胞的相关成骨基因Bmp2、Alp、Col1、Msx2、Runx2的表达高于PP膜(P<0.05)。结论　本实验制备的PP-B膜能促进MC3T3-E1细胞在体外的早期成骨分化。     

rhBMP-2诱导成肌细胞表达成骨表型的研究

目的：检测不同浓度rhBMP-2对诱导成肌细胞成骨表型表达的影响，探索诱导成肌细胞表达成骨表型的rhBMP-2的最适浓度。方法：采用双重酶消化法获取SD大鼠乳鼠的成肌细胞，纯化后，在含15％胎牛血清的DMEM培养液中培养。取第3代培养细胞，按培养液中不同rhBMP-2浓度分组，分为0、0．1、0．5、1．0、1．5和5．0μg／ml共6组（0μg/ml组为对照组1，培养1、2和4周。收集不同时期细胞培养上清液和细胞爬片进行检测，检测指标为：细胞形态和数量、碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素（OCN）含量、Ⅰ型胶原合成量和钙化结节染色。采用SPSS10．0统计软件包进行统计分析。各组间比较采用方差分析（ANOVA）。结果：应用rhBMP-2后，梭形成肌细胞减少，圆形或多突形成肌细胞明显增加，细胞呈集结性生长，培养4周可形成不透光结节。低、中浓度（0．1-1．5μg／ml）rhBMP-2组细胞数量和对照组之间无显著性差异（P〉0．05），但高浓度（5．0μg／ml）rhBMP-2组细胞数量显著下降（P〈0．05）。0．1～1．5μg／ml 4组rhBMP-2均能促进成肌细胞合成分泌ALP、OCN和Ⅰ型胶原（所有组与对照组比较，P〈0．05），其中0．5和1．0μg/ml 2组促进作用更显著。细胞培养4周后，茜素红S染色法示结节呈红色钙阳性反应。结论：低、中浓度（0．1～1．51μg／ml）rhBMP-2对成肌细胞增殖无显著影响，但高浓度（5．0μg/ml）rhBMP-2可显著抑制成肌细胞增殖。rhBMP-2可有效诱导成肌细胞表达成骨细胞各项表型并能体外成骨，其中0．5～1．01μg／ml是一个较为适宜的诱导浓度。     

淫羊藿苷对MC3T3-E1增殖及成骨分化的影响研究

目的：研究传统中药淫羊藿的主要活性成分淫羊藿苷(icariin,ICA)对小鼠颅顶前成骨细胞(preosteoblasts in mice calvarium,MC3T3-E1)的细胞活性及成骨分化的影响。方法：筛选出ICA的最佳干预浓度，将MC3T3-E1细胞分为空白对照组及不同浓度的实验组，实验组以含10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5 mol/L的ICA完全培养液分别处理MC3T3-E1细胞。分别于培养2、4、6 d后用CCK8试剂盒检测MC3T3-E1细胞增殖能力；于培养3、6、9 d后用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测其ALP活性；根据检测结果，分别用完全培养液、成骨诱导液、含10^-7 mol/L的ICA完全培养液处理MC3T3-E1细胞21 d后，再分别作茜素红染色。结果：与空白对照组相比，药物处理组明显抑制了MC3T3-E1细胞的增殖，但促进了MC3T3-E1细胞的ALP活性；而不同浓度的I...     

不同浓度无机磷对MC3 T3-E1细胞系成骨及破骨相关基因表达的影响

目的：探讨不同浓度的无机磷液对体外培养MC3T3-E1细胞的成骨和破骨相关基因mRNA表达的影响。方法：体外常规培养MC3T3-E1细胞。根据所用培养液外加无机磷浓度的不同,将实验细胞分为4组：0 mM组（对照组）、1 mM组、3 mM组和5 mM组。每组设3个复孔,培养48 h后收取细胞标本,通过Real-time PCR检测MC3T3-E1细胞成骨和破骨相关基因mRNA的表达。结果：与对照组相比,成骨相关基因ALP、BSP、OC及OSXmR-NA的表达在1 mM组和3 mM组增加,而在5 mM组则减少,差异具有统计学意义（ P＜0.05）;成骨抑制基因SOST及破骨相关基因CTSK、TRAPmRNA的表达,在1 mM 组、3 mM 组和5 mM 组都增加,差异具有统计学意义（ P ＜0.05）。结论：高浓度（5 mM）的无机磷环境对MC3T3-E1细胞的成骨相关基因表达起显著抑制作用,对破骨相关基因表达起显著增强作用,提示高浓度无机磷抑制MC3T3-E1细胞的成骨活性。