重组 GST-β-GT 融合蛋白的原核表达、纯化及活性鉴定

目的：构建噬菌体β‐GT蛋白的原核重组体系,诱导表达、纯化GST‐β‐GT 融合蛋白并对其进行酶活性测定。方法利用PCR技术从T4噬菌体中扩增β‐GT基因;经T‐A克隆,获得β‐GT基因片段,经酶切连接,构建原核表达载体pGEX‐6P‐1‐β‐GT ;经测序鉴定序列正确后,将所构建的载体转化进入大肠埃希菌BL21（DE3）中进行表达。利用IPTG诱导,经10％ SDS‐PAGE鉴定目的蛋白表达后,采用GST柱纯化目的蛋白;通过酶切和qPCR鉴定其活性。结果成功扩增了噬菌体β‐GT基因;重组质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达出GST‐β‐GT融合蛋白;通过GST柱纯化后获得了GST‐β‐GT融合蛋白,纯度达95％;通过酶切和qPCR验证,此GST‐β‐GT融合蛋白具有T4‐β‐GT酶的活性。结论。原核表达GST‐β‐GT融合蛋白具有糖基转移酶活性。     

CASP8AP2基因表达调控、功能与临床价值研究进展

我们系统总结了有关CASP8AP2基因的表达调控、生物学功能及其临床预后价值的研究报告。现有研究显示,CASP8AP2基因的表达受到同源盒蛋白和DNA甲基化的调控,miRNA-210能够使其表达沉默。CASP8AP2的生物学功能包括:参与FAS和TNFα介导的细胞凋亡、TNFα介导的NF-κB活化、糖皮质激素和盐皮质激素受体介导的基因转录调控、组成Cajal体和组蛋白位点体、复制依赖性组蛋白的转录和前体mRNA的3'端加工成熟、调控细胞周期S期进展,还能作为转录因子c-Myb、p73的辅助激活因子参与调控多种基因的转录。同时,CASP8AP2基因低表达与儿童ALL的复发相关;在儿童T-ALL和T淋巴母细胞淋巴瘤中,CASP8AP2基因的缺失较为常见,与患儿的较差预后相关。另外,在CASP8AP2基因序列中的3个单核苷酸多态性位点可能与弥漫性大B细胞淋巴瘤和白血病的发生有关。结论:CASP8AP2是一个多功能蛋白,具有调控细胞增殖、凋亡、基因表达等多种生物学功能,在儿童血液系统恶性肿瘤中,CASP8AP2基因还是一个有价值的预后标志物,部分单核苷酸多态性可能与白血病、淋巴瘤的发病相关。     

中药治疗乳痈处方分析

目的:调查门诊乳痈患者中药使用情况,以期为临床安全、有效治疗乳痈提供用药参考.方法:对我院201例治疗乳痈的中药处方进行回顾性调查和分析.结果:使用201例中药处方中大部分含中药14~19味(83.09%);平均每例每日用药金额为24.6213元;使用药类频数最高的是清热药,为1141次,频率为34.1%;其次为活血化瘀药;频次为476次,频率为14.2%;解表药的使用频次为374,频率11.2%.三者在六大药类中占绝大比例,为58.5%.结论:201张中药处方治疗乳痈主要以清热、祛瘀、疏肝、消肿为法,用药以清热药、活血化瘀药、解表药三者联用为主,其中清热类以清热解毒药与清热凉血药居多.故本院多为郁滞期(初期)乳痈患者,多以仙方活命饮、神效瓜蒌散、瓜蒌牛蒡汤等基本方加减治疗,处方用药符合病机特点,但处方药味数在辩证论治的基础上进一步优化.     

用Western Blot和原位杂交法研究Shh在小鼠牙胚钟状晚期的表达

目的 从形态学和半定量分析两方面研究Shh(Sonic Hedghog)基因在小鼠牙胚钟状晚期的表达，探讨Shh在牙胚钟状晚期的生物学作用。方法 取出生后1、2、3、5和7d(P1,P2,P3,P5,P7)的Bal b/c纯系小鼠牙胚，用Western印迹方法检测Shh的表达量；原位杂交检测Shh在出生后1d和3d天乳鼠牙胚中的表达部位与强度。结果 钟状晚期Shh特异表达于成釉细胞层，其强度随出生天数增加而减弱；随着成釉细胞发育成熟，44500Shh表达量逐渐降低，P1的吸光光度值为P7的5.5倍，P1，P2与P3可检测出活性Shh-N片段。结论 Shh在钟状晚期特异地表达于成釉细胞层，其表达量与成釉细胞的功能状态有关。     

氨肽酶N在兔肝脏的表达及胆汁中活性的研究

我们通过检测氨肽酶Ｎ(ＡＰＮ)基因和ＡＰＮ蛋白在肝脏的表达及其在胆汁中的活性 ,探讨ＡＰＮ在胆固醇结石发生中所起的作用。一、材料和方法1 .动物模型 :新西兰白兔 ( 30只 ) ,雌雄各半 ,体重 2 .0 0～ 2 .50ｋｇ(北京大学医学部实验动物中心提供 )。普通饲料饲养 1周后 ,随机分为两组 :对照组 ( 1 0只 ) :每日喂普通颗粒饲料 1 0 0 ｇ ;结石组( 2 0只 ) :每日喂饲 1 .2 %的高胆固醇饲料 1 0 0 ｇ并分成 1 0ｄ组和 4周组 ,各 1 0只。实验前 ,动物禁食 1 2ｈ ,禁水 6ｈ ,3%戊巴比妥 ( 30～ 4 0ｍｇ/ｋｇ体重 )耳缘静脉注射麻醉 ,开腹 ,迅速…     

利用重组人α乳清蛋白和油酸大量快速制备高活性的HAMLET肿瘤杀伤复合物

目的可致肿瘤细胞死亡的人α乳清蛋白(human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells,HAMLET)是一种可导致多种癌细胞死亡的强效选择性肿瘤杀伤蛋白质-脂酸复合物。为了使HAMLET应用于肿瘤的治疗并对其杀伤机制进行探讨,我们需要建立和优化简便、快速、规模化制备与纯化HAMLET的方法。方法通过构建人α乳清蛋白分泌型细胞MCF-7的cDNA文库,PCR扩增出编码人α乳清蛋白成熟肽段的全长序列,然后克隆入pET30a(+)表达载体质粒,并转化BL21(DE3)宿主大肠杆菌。经过IPTG诱导,表达细菌的裂解,蛋白体外复性,Ni-NTA亲和层析柱纯化等步骤,获得了高纯度的重组人α乳清蛋白的C端His标签融合蛋白。纯化蛋白经EDTA脱钙后,与油酸(oleic acid,OA)在加热条件下制备HAMLET复合物。同时,对HAMLET的理化特性和生物学活性进行检测。结果通过与经典方法制备的牛α乳清蛋白和OA复合物(BAMLET)进行比较,发现我们制备的HAMLET在紫外吸收光谱、疏水性质特征及肿瘤杀伤活力方面与BAMLET活性相符,并且可引起HeLa肿瘤细胞的凋亡样程序性死亡。结论本研究自主制备的HAMLET成本经济、方法简便且具有较好的规模化放大前景,为日后临床应用奠定基础。     

竹红菌甲素敏化E．coli菌体蛋白光氧化反应及机制

本工作利用ＳＤＳ聚丙烯酰胺胶电泳技术分析了甲素对Ｅ．ｃｏｌｉ菌体蛋白光氧化的敏化作用。实验结果表明，甲素结合光照可引起菌体蛋白降解及交联。甲素敏化菌体蛋白光氧化反应可放单线态氧淬灭剂──ＮａＮ３抑制，但不被各种氧自由基、羟自由基抑制剂所阻断，提示甲素敏化的菌体蛋白光氧化反应属Ⅱ型机制。     

蛋白激酶C突变体的构建及其在C2C12细胞中的表达

本实验构建了4个蛋白激酶C(PKC)α突变体-GFP真核表达载体,并使它们在C2C12细胞中得到表达,为研究PKCα结构与转位的关系奠定了基础.     

先天性心脏病的分子遗传学研究进展

先天性心脏病(CHD)是新生儿出生缺陷常见畸形之一,包括肺动脉狭窄、法乐氏四联症、大血管错位、永存动脉干、三尖瓣闭锁、房间隔缺损、室间隔缺损和动脉畸形等。我国报告患病率为6.87‰～14.39‰,国外资料显示患病率为3.70‰～8.56‰。以前的分子遗传学和分子流行病学分析表明,CHD大多数系多因素所致,即是一个或多个等位基因在多个位点随机作用、或与环境因素综合作用的结果,仅8％的CHD由单基因缺陷所致,2％由环境因素引起。尽管CHD的临床诊断和治疗已取得很大进展,但目前对CHD发病的分子机理还了解甚     

竹红菌甲素敏化菌体蛋白的光氧化及其机制

本文以 E.cooli 菌体蛋白为靶分子,采用光敏反应和 SDS—PAGE 技术分析了竹红菌甲素对蛋白质光敏氧化反应的敏化作用及其机制。研究结果表明,甲素可敏化蛋白质分子的光动力降解及分子交联。蛋白质分子的光动力降解及分子交联可被~1O_2猝灭剂 NaN_3抑制,而 O_2和 HO~-猝灭剂对反应未见明显影响,揭示甲素敏化蛋白质的光氧化由~1O_2介导,按Ⅱ型反应机制进行。