ActR Ⅱ B-Fc融合蛋白生物学活性测定方法的建立

目的:建立ActR ⅡB-Fc融合蛋白的生物学活性检测方法.方法:利用A204-CAGA12-LUC细胞系,通过荧光素酶检测系统进行ActR ⅡB-Fc融合蛋白的生物学活性检测,根据四参数拟合分析计算样品相对效价,并对该方法的专属性、精密性和准确性进行验证.结果:ActR ⅡB-Fc融合蛋白在该方法中存在量效关系,且符...     

抗HER2单抗注射液(皮下注射)的质量控制

目的 研究并建立针对抗HER2单抗注射液(皮下注射)的关键质量属性质控方法。方法 分别采用胰蛋白酶或Lys-C酶切结合反相高效液相色谱法(reversed-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)的肽图分析法进行抗HER2单抗的特异性鉴别。采用还原/非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate, CE-SDS)和分子排阻色谱(size-exclusion chromatography, SEC)法进行纯度控制。采用阳离子交换色谱(ion-exchange chromatography, IEC)法进行电荷异质性分析。采用亲水相互作用液相色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)法进行寡糖图谱分析。采用酶活力测定法分析透明质酸酶含量。采用BT474细胞增殖抑制法测定生物学活性。采用紫外分光光度法测定蛋白含量。结果 两种肽图检测法均获得特征图谱，对抗HER2单抗发挥很...     

抗CD19单抗的质量控制研究

目的：研究并建立针对抗白细胞分化抗原19(Cluster of Differentiation 19,CD19)单抗的关键质量属性质控方法。方法：运用肽图对抗CD19的单抗进行鉴别;采用还原/非还原十二烷基磺酸钠毛细管电泳(Capillary Electrophoresis-sodium Dodecyl sulfonate,CE-SDS)和分子排阻色谱(Size ExclusionHigh Performance Liquidchromatography,SEC-HPLC)进行单抗纯度的控制;运用成像毛细管等电聚焦电泳(Imaging Capillary Isoelectricfocusing Electrophoresis,iCIEF)测定电荷异质性;运用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分析抗CD19单抗的糖基化,采用基于报告基因的抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity,ADCC) 测定生物学活性。其他各项指标均应符合现行版《中华人民共和国药典》以及其他相关要求。结果： 肽图检测抗CD19单抗具有相应的特征图谱,能够用于鉴别;还原CE-SDS的轻链与重链峰面积之和百分比为(98.77±0.05)%;非还原CE-SDS主峰峰面积百分比为(96.19±0.05)%,片段百分比为 (3.81±0.05)%;SEC-HPLC单体的峰面积百分比为(99.42±0.001)%,聚合物峰面积百分比为 (0.54±0.001)%;iCIEF分析的主要亚型的峰面积百分比为(66.41±0.38)%,酸性亚型的峰面积百分比为(13.69±0.16)%,碱性亚型的峰面积百分比为(19.90±0.46)%;在糖型分析中,占比最高的三个糖型分别为G0、G0-GN和M5,G0的含量为(64.64±0.61)%,G0-GN的含量为(9.75±0.42)%, M5含量为(6.22±0.35)%,生物学活性的半数最大效应浓度(Concentration for 50% of Maximal Effect, EC₅₀)值为(10.09±1.40)ng·mL^-1。结论：针对抗CD19单抗的关键质量属性,研究并建立了相应的质量控制方法,以确保其安全、有效和质量可控,为该类单抗产品的质量控制方法和策略提供参考依据。     

近效期末抗PD-1单克隆抗体药物使用过程中稳定性研究

目的：评价近效期末抗程序性死亡受体1(Programmed Cell Death Protein Ligand 1，PD-1)单克隆抗体药物的使用中稳定性。方法：模拟临床实际使用条件将近效期末抗PD-1单抗药物稀释至1.0 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1，制备使用中稳定性样品，并对不同取样点下样品的外观、可见异物、不溶性微粒、蛋白质浓度、纯度、配体竞争抑制活性、生物学活性进行分析和比较。结果：1.0 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1 2个浓度点在不同时间取样点样品均为无色澄清溶液且无明显可见异物，不溶性微粒符合要求；蛋白质浓度分别为0.9 mg·mL-1和4.3~4.5 mg·mL-1；SEC-HPLC单体的峰面积百分比均为99.3%， 聚体峰面积百分比为0.7%~0.8%；配体竞争抑制活性为95%~110%，生物学活性为74%~89%。结论：研究表明近效期末抗PD-1单抗药物使用中稳定性良好。     

抗白介素-13单克隆抗体生物学活性测定方法的建立

目的：建立抗白介素-13单克隆抗体(抗IL-13单抗)的生物学活性检测方法。方法：利用 L-BEAS-2B细胞系，通过荧光素酶检测系统进行抗IL-13单抗的生物学活性检测，通过抗IL-13单抗参比品与样品对比以平行线分析的方法计算样品相对百分效价，并对该方法的精密性和准确性进行验证。 结果：抗IL-13单抗在该方法中存在量效关系，在半对数坐标纸上呈平行的直线分布。6批抗IL-13单抗样品经3次测定，相对百分效价平均值在(91.10±1.10)%~(105.27±7.17)%之间，RSD均小于12%； 1批样品经9次测定平均相对百分效价为(110.77±7.01)%，板间和日间RSD均小于7%；2批回收率样品经3次测定，回收率分别为(96.17±8.50)%和(91.53±15.46)%。结论：研究建立的抗IL-13单抗生物学活性检测方法准确性高，精密度及重复性好，可作为抗IL-13单抗生物学活性的常规检测方法。     

NSO细胞DNA首批国家标准品的建立

目的建立小鼠骨髓瘤NSO细胞DNA含量测定国家标准品。方法使用QIAGEN基因组DNA纯化试剂以及Genomictip 500/G制备了NSO细胞DNA作为标准物质原料。通过紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳进行纯度和含量测定,每支100μL分装于螺口冻存管。组织5个独立实验室应用紫外分光光度法对我国第一批NSO DNA国家标准品进行协作标定,并评价DNA标准物质的稳定性与适用性。结果所制备的NSO细胞DNA标准品经检测,A260/A280均在1.7~1.9之间,电泳图谱条带单一,纯度符合要求。该DNA标准品经5家实验室协作标定共90次,几何平均含量为87.5μg·mL^-1,平均含量的95%可信区间为86.6~88.5μg·mL^-1。短期稳定性实验表明,该标准品在4℃条件下放置4个月,DNA标准品浓度测定值及/1260/无显著性差异;-20、-70℃贮存1年的长期稳定性结果显示,标准品DNA浓度测定值及A260/A280无显著性差异,电泳条带单一,因此该标准物质应在-20℃条件以下长期保存。在标准品适用性研究中,利用该标准品进行定量PCR法测定,在3 fg·μL^-1~300 pg·μL^-1之间线性良好,标准曲线r^2值>0.999。结论该批NSO DNA国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品用于定量PCR法检测NS0细胞DNA残留量,DNA标准品含量赋值为87.5μg·mL^-1,批号为330002-201701。     

AlphaLISA方法测定抗白介素-17受体单抗生物学活性

目的：利用AlphaLISA方法建立抗白介素-17受体单抗的生物学活性测定方法。方法：以人包皮成纤维细胞系作为靶细胞,通过AlphaLISA检测系统建立抗IL-17R单抗的生物学活性测定方法,根据四参数拟合分析计算抗IL-17R单抗的相对效价,并对该方法进行了验证。结果：抗IL-17R单抗在该方法中存在量效关系,并且符合四参数方程：y=（A-D）/[1+（x/C）^B]+D。6批抗IL-17R单抗经3次测定,相对效价平均值在（84.93±3.12）%~（107.51±1.66）%,相对标准偏差小于5%。2批回收率样品经3次测定,回收率分别为（100.66±13.65）%和（115.69±3.85）%。结论：本研究利用AlphaLISA方法在国内首次成功建立重复性好、准确性高的抗IL-17R单抗的生物学活性测定方法。     

抗白介素-13单克隆抗体生物学活性测定方法的建立

目的:建立抗白介素-13单克隆抗体(抗IL-13单抗)的生物学活性检测方法。方法:利用L-BEAS-2B细胞系,通过荧光素酶检测系统进行抗IL-13单抗的生物学活性检测,通过抗IL-13单抗参比品与样品对比以平行线分析的方法计算样品相对百分效价,并对该方法的精密性和准确性进行验证。结果:抗IL-13单抗在该方法中存在量效关系,在半对数坐标纸上呈平行的直线分布。6批抗IL-13单抗样品经3次测定,相对百分效价平均值在(91.10±1.10)%~(105.27±7.17)%之间,RSD均小于12%;1批样品经9次测定平均相对百分效价为(110.77±7.01)%,板间和日间RSD均小于7%;2批回收率样品经3次测定,回收率分别为(96.17±8.50)%和(91.53±15.46)%。结论:研究建立的抗IL-13单抗生物学活性检测方法准确性高,精密度及重复性好,可作为抗IL-13单抗生物学活性的常规检测方法。     

利用实验设计优化和建立抗CD38单克隆抗体ADCP生物学活性测定方法

利用实验设计(design of experiment,DoE)方法建立抗CD38单抗(monoclonal antibody,mAb)的抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis,ADCP)生物学活性检测方法。以Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ转基因细胞系作为效应细胞,Daudi细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(BrightGlo^TMLucifer‐ase Assay system)检测抗CD38单抗的ADCP生物学活性,并运用DoE方法进行实验参数优化。结果显示,抗CD38单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)~B]+D,方法经统计学实验设计对多个实验参数进行筛选和优化,确定抗体工作浓度为800～20.81 ng·mL^-1,靶细胞和效应细胞的接种量分别为每孔7.5×10~4和2.5×10~4个,诱导时间为6 h。该方法具有良好的专属性;5个不同组回收率样本经3次检测,相对效价分别为(59.97±4.74)%...     

纳米级差示扫描荧光法在阿达木单抗热分析中的应用

目的:探讨纳米级差示扫描荧光法(nanoDSF法)检测阿达木单抗熔解温度(T_m)的可行性及潜在应用。方法:采用nanoDSF技术对0.25、0.5、1、5、10、50 mg·mL^-1 6个不同浓度下的阿达木单抗T_m进行检测，检测过程中参数设置：升温区间为25～95℃,升温速率为1℃·min^-1,收集内源性荧光信号测得T_m,重复检测5次。通过将阿达木单抗与制剂缓冲液的T_m检测结果进行比较，确认方法的特异性；通过6个不同浓度下阿达木单抗5次T_m检测结果的离散度评估，得到方法的精密度；通过将0.25、0.5、1 mg·mL^-1 3个浓度下阿达木单抗的T_m检测结果与相应浓度下的差式扫描量热法(DSC法)检测结果进行比较，对nano DSF技术的检测准确性进行评价；进行上述方法学验证后，将该技术应用于阿达木单抗原研药与6种生物类似药T_m的相似性评价。此外，本研究还通过收集抗体分子...