注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白生物学活性检测方法学研究

目的通过对注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测方法进行研究,建立该药物的生物学活性检测方法。方法参考重组人干扰素生物学活性测定法,以人羊膜细胞(WISH)病变抑制法开展注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测方法研究。结果该方法的专属性好,精密度试验中生物学活性相对标准偏差(RSD)为10.6%,准确性试验平均回收率98.2%,RSD为9.0%,符合生物制品质量检验方法要求。结论本研究制定的实验方法准确、可靠,适用于注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测。     

FGF21-Fc融合蛋白体外活性试验的建立和优化

成纤维细胞生长因子-21(FGF21)-Fc融合蛋白体外活性试验的建立分为蛋白水平的结合活性试验和细胞水平的生物学活性试验2种。该研究建立了均相时间分辨荧光(HTRF)法用于检测FGF21-Fc融合蛋白与β-Klotho配体蛋白的结合活性;并自主构建了报告基因细胞,当FGF21-Fc融合蛋白与β-Klotho的结合,激活其FGF受体和诱导胞内信号转导所必需的共同受体,可通过检测萤光素酶活性,间接定量测定生物学活性。在建立过程中,分别对结合活性试验中样品和配体的浓度、供体和配体的稀释比例以及孵育时间进行优化,并进行了方法学验证,证明该HTRF技术具有良好的重复性和特异性,可用于FGF21-Fc融合蛋白和β-Klotho的结合活性检测。随后,对生物学活性试验中胎牛血清的浓度、报告基因细胞的密度、试验板的类型以及细胞种板形式进行优化,并进行了方法学验证,证明该报告基因法具有良好的重复性和特异性,可用于FGF21-Fc融合蛋白的生物学活性检测。本研究建立了FGF21-Fc融合蛋白的质控方法,为有同样活性检测难点的药物提供了一种分析技术参考,填补了国内外空白。     

增强型绿色荧光蛋白与IgG抗体亲和肽融合蛋白的制备

目的构建、表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与IgG抗体亲和肽融合蛋白,并对其生物学功能进行研究。方法将EGFP基因与IgG抗体亲和肽基因重组,构建原核分泌表达载体pSpA-EGFP-His,通过竞争ELISA和荧光光谱测定,考察其在大肠杆菌中表达产物SpA-EGFP融合蛋白的生物学活性。结果SpA-EG-FP融合蛋白的相对分子质量42kD,与理论值相近,荧光光谱与文献报道一致,且能与SpA-Peroxidase竞争结合反应体系中的兔IgG抗体。结论SpA-EGFP融合蛋白在E.coliDH5α中正确表达,且具有EGFP的荧光特性和与哺乳动物IgG抗体结合的生物学活性。     

CREKA/tTF融合蛋白表达及活性鉴定

目的制备用于靶向肿瘤血管中的凝血血浆蛋白的CREKA/tTF融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术构建CREKA与tTF的融合基因,克隆至表达载体pET22b(+),在E.coli BL21中表达,镍亲和色谱柱纯化,梯度透析复性。利用凝血时间,结合荧光定量测定等实验在体外鉴定该融合蛋白的活性。结果获得序列正确的CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,融合蛋白在E.coli BL21中高效表达。纯化后的融合蛋白具有引起血液凝固的功能,且能与凝血血浆蛋白结合。结论成功构建CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,CREKA/tTF融合蛋白具有TF凝血活性及CREKA的结合活性。     

人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的:研究人cTnI基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化.方法:以pCOMb3-cTnI为模板,用PCR方法得到了编码该蛋白的基因,进一步将该基因克隆到中间载体pUCm-T,再酶切得到cTnI基因插入到pKL载体中,构建成表达质粒pKL-cTnI.在BL21细胞中经IPTG诱导表达,利用载体携带6×His纯化标签,以HisTrap Kit纯化重组蛋白,并进行免疫活性测定.结果:融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并用HisTrapKit成功纯化目的蛋白.ELISA分析证实该重组蛋白具有与天然心肌肌钙蛋白相似的免疫活性.结论:本研究为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础.     

重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白质控方法和标准的研究

目的建立重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白质控方法和质量标准。方法用中和TNF-α生物学活性的方法测定重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白效价,用胰蛋白酶酶切分析肽图,用ELISA方法分别测定蛋白A、残留宿主细胞蛋白残留量和重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白含量。结果建立了重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的生物学活性、肽图分析、残留蛋白A等质控方法和质量标准。结论建立的方法和质量标准已用于重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白产品的检定。     

小鼠β-防御素3的原核表达、表达条件优化及其抗菌活性

目的 运用基因工程方法获得重组小鼠β-防御素3(MBD3),优化表达条件,并研究其抗菌活性.方法 通过反转录PCR方法从小鼠肺组织中扩增Mbd3基因,构建其原核表达质粒,将该质粒转入大肠埃希菌表达菌株Rosetta-gami(2).优化融合蛋白的表达条件.通过亲和层析、凝血酶酶切、超滤浓缩得到MBD3的重组成熟肽(rMBD3),并采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和Western blot鉴定其正确性.采用微量液体抗菌实验检测rMBD3对多种常见病原性细菌和真菌的抗菌活性.结果 获得表达MBD3融合蛋白(fMBD3)的工程菌,fMBD3的表达量可达菌体总蛋白的62.9％,可溶性fMBD3约为1.15 g/L.纯化的rMBD3对单细胞真菌和革兰阳性菌显示出较好的抑菌活性.结论 rMBD3具有一定的抗菌活性,为进一步研究该多肽的其他生物学活性及其应用提供参考依据.     

CaMKⅡα/β稳定表达的PC12细胞株的构建及其功能的初步研究

目的建立稳定表达CaMKⅡα/β的PC12稳定细胞株,以便进一步研究钙/钙调素依赖性蛋白激酶CaMKⅡα/β不同亚型的生理功能。方法通过脂质体介导的方法将构建的表达载体pEGFP-CaMKⅡα/β转染入PC12细胞中,然后用含G418抗生素的选择性培养基进行长期筛选,挑取耐药单克隆,培养并收集耐药的单克隆细胞;通过MTT法检测转染细胞在体外对PC12细胞增殖与活性的影响;Westernblot分析稳定表达的pEGFP-CaMKⅡα/β不同亚型对PC12细胞中相关突触囊泡蛋白表达的影响;并用高效液相色谱法(HPLC)检测过表达的CaMKⅡα/β对PC12细胞神经递质多巴胺DA释放的影响。结果 MTT细胞活性检测结果显示,转染重组质粒pEGFP-N1-CaMKⅡα/β的PC12细胞稳定株的生长活性与对照组相接近。应用Western blot方法对融合蛋白CaMKⅡα/β-GFP在PC12细胞内的表达进行鉴定,结果显示在PC12-CaMKⅡα/β组中,分子量82/89 ku处检测到该目的基因的大量表达,而在对照组的相应位置则没有任何条带,表明外源性目的基因已在细胞内过表达。West-ern blot方法检测突触囊泡蛋白结果显示CaMKⅡα/β不同亚型的过表达对囊泡蛋白的影响并无差异。HPLC检测结果显示过表达的CaMKⅡα/β对PC12细胞中DA的释放差异具有显著性。结论该实验获得稳定表达pEGFP-CaMKⅡα/β的PC12细胞株。初步探讨了该激酶的不同亚型对细胞功能的影响。     

Exendin-4与绿色荧光蛋白融合基因的表达与活性研究

目的:表达具有双功能特性的Exendin-4-GFP融合蛋白。方法:构建融合表达载体pET21a( )/Exendin-4-GFP,转化大肠杆菌BL21后,以IPTG诱导融合蛋白的表达,并利用镍金属螯合层析树脂对其进行纯化。采用胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)转染的CHO细胞考察融合蛋白的结合特性,并检测其生物活性。结果:含有融合表达载体的重组菌株诱导表达后,经SDS-PAGE及免疫印迹分析显示,31.0ku的融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,且具有Exendin-4的抗原活性。受体结合实验表明,该融合蛋白能够与GLP-1R特异性结合,在488nm激发光下呈现绿色荧光。体内活性实验表明,融合蛋白具有明显的降血糖活性。结论:本研究表达的Exendin-4-GFP融合蛋白同时具有Exendin-4的活性和荧光特性,为研究GLP-1受体功能以及Exendin-4与细胞相互作用的机制奠定了基础。     

重组金葡菌肠毒素O的克隆表达及生物学活性分析

克隆金葡菌肠毒素O(SEO)的全长基因，实现其可溶性表达,并对纯化的表达产物进行生物学活性分析。从金葡菌FRI 100菌株基因组中得到SEO基因，克隆至谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌，获高效表达。融合蛋白GST-SEO经Glutathione Sepharose 4B亲和纯化和凝血酶消化获重组SEO(rSEO)后，MTT法检测脾淋巴细胞的增殖作用，分析纯化后rSEO的生物学活性。测序结果表明，得到正确的肠毒素SEO基因序列，并获高效表达的融合蛋白；MTT结果表明，rSEO具有与SEC相当的显著的促淋巴细胞增殖以及抑制肿瘤细胞生长的能力。本研究成功克隆、表达、纯化了具有抗肿瘤生物学活性的rSEO蛋白，为进一步研究该蛋白的抗肿瘤机制奠定了基础，并有望成为一种新的超抗原制剂用于肿瘤的临床治疗。     

重组融合蛋白抗CD20Fab-LDM的构建、表达及体外活性研究

目的构建和表达抗CD20Fab-LDP(力达霉素辅基蛋白)融合蛋白,制备强化融合蛋白抗CD20Fab-LDM(力达霉素),并测定该融合蛋白的生物学活性。方法采用PCR和overlapPCR方法构建抗CD20Fab-LDP融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot鉴定纯化产物;采用FACS方法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用冷乙二醇法制备强化融合蛋白抗CD20Fab-LDM;采用MTT法鉴定抗CD20Fab-LDM对CD20+Raji细胞特异性的细胞毒作用。结果DNA序列测定结果表明抗CD20Fab-LDP融合蛋白已构建成功,可溶性表达产物的产量可达4mg.L-1以上,具有与Raji细胞(CD20+)结合的活性,与抗CD20Fab的亲合常数相当,抗CD20Fab-LDM体外能特异性杀伤Raji细胞,IC50值为0.9×10-10mol.L-1。结论成功地构建了抗CD20Fab-LDP融合蛋白,并获得可溶性高效表达,表达产物具有与相应靶抗原结合的活性,并成功制备了抗CD20Fab-LDM强化融合蛋白,体外能特异性杀伤CD20+的Raji细胞。     

重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白(rhG-CSF-Fc)的质量研究

目的:建立重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白的质控方法和质量标准。方法:采用NSF-60细胞增殖法测定生物学活性;非还原SDS-PAGE电泳和RP-HPLC测定纯度;以ELISA法分别测定残留CHO细胞蛋白和蛋白A;其余检测项目按中国药典2010年版三部规定进行。结果:用建立的方法对重组人粒细胞集落刺激因子-Fc融合蛋白原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和中国药典2010年版三部的要求。结论:建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全有效、质量可控的特点,可用于该类产品的常规检定。     

肺癌靶向血栓蛋白hu3D3V_H-tTF的表达及活性鉴定

目的制备一种用于肺癌血管靶向栓塞治疗的融合蛋白hu3D3VH-tTF,并鉴定其生物学活性。方法利用重叠PCR技术构建tTF与hu3D3VH的融合基因,克隆至表达载体pET22 b(+),在E.coliBL21(DE3)中表达,镍亲和色谱柱纯化目的蛋白。ELISA检测融合蛋白hu3D3VH组分与肺腺癌细胞A549选择性结合活性,凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白tTF组分的促凝血活性。结果获得序列正确的hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达。纯化后的融合蛋白与肺腺癌细胞A549具有选择性结合活性,并能活化FⅩ、有效促发血液凝固。结论成功构建hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,hu3D3VH/tTF融合蛋白具有hu3D3VH的选择性结合能力同时具有TF的促凝血活性,为开展选择性肺肿瘤血管血栓性栓塞研究奠定了基础。     

三七总皂甙对吗啡戒断大鼠海马组织CaMK Ⅱ活性及CaMK Ⅱ α亚基蛋白表达的影响

目的:研究三七总皂甙(Panax notoginseng,PNS)对吗啡戒断大鼠海马组织CaMK Ⅱ活性及CaMK Ⅱα亚基蛋白表达的影响,探讨PNS抑制吗啡戒断症状的作用机制。方法:应用剂量递增法建立大鼠吗啡躯体依赖模型(MOR组),采用腹腔注射(ip)纳洛酮建立催促戒断模型(NAL组),大鼠在给予吗啡的同时,采用3种不同剂量PNS(100、200、400mg·kg-1)进行灌胃(ig)。应用放射酶法测定CaMK Ⅱ活性,Western blot方法检测CaMK Ⅱα亚基蛋白表达。结果:(1)MOR组CaMK Ⅱ活性降低,CaMK Ⅱα亚基蛋白表达升高;(2)NAL组CaMK Ⅱ活性和CaMK Ⅱα亚基蛋白表达均显著升高;(3)PNS可以剂量依赖性地抑制纳洛酮催促戒断所引起CaMK Ⅱ活性和CaMK Ⅱα亚基蛋白的升高。结论:PNS可能通过抑制纳洛酮催促戒断所引起的CaMKⅡ活性和CaMK Ⅱα亚基蛋白表达的升高来缓解大鼠吗啡戒断症状。     

重组脂联素融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的 表达重组脂联素融合蛋白(adiponectin-Trx),并测定其生物学活性.方法 从小鼠脂肪组织提取总RNA,应用序列特异性引物经RT-PCR方法扩增获得全长脂联素基因序列,克隆至pGEM-T载体,序列经DNA测序证实.将目的 序列(18-247氨基酸)亚克隆至pET-32(a)表达载体,重组质粒adiponectin/pET32(a)的序列经测序证实.将adiponectin/pET32(a)转化表达宿主菌OrigamiTM(DE3),在27℃以1mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达目的 蛋白,SDS-PAGE和氨基酸测序检测目的蛋白的表达,目的 蛋白经组氨酸镍螫和树脂亲和纯化.以不同浓度的融合蛋白adiponectin-Trx和Trx蛋白处理体外培养的人脐静脉内皮细胞,细胞增殖法测定其生物学活性.结果 小鼠脂肪组织脂联素基因的编码序列,337位点上的碱基A被C置换,导致在113位的蛋氨酸被缬氨酸取代.序列测定表明,构建的重组表达载体adiponectin/pET32a序列完全正确,诱导工程菌主要表达可溶性的融合蛋白adiponectin-Trx,部分以包含体形式表达.表达产物的相对分子量(Mr)同预期分子量相同,adiponectin-Trx Mr为43 000,Trx Mr为19 000.在低浓度时融合蛋白刺激人脐静脉内皮细胞增殖.结论 小鼠脂肪组织脂联素基因编码序列与来自3T3-L1脂肪细胞的编码序列不同.成功地在E.coli中表达了重组脂联素融合蛋白并具有生物学活性.     

人脂联素基因在L-02细胞中表达及其功能检测

目的:在人正常肝细胞株L-02中表达外源人脂联素蛋白,并观察其生物学活性。方法:采用脂质体法将成功构建的人脂联素真核表达质粒pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-Adiponectin转染L-02细胞;免疫组织化学定位观察脂联素的表达;Western blot检测培养上清及细胞沉淀中脂联素水平;酶联免疫法测定培养基血糖。结果:构建的真核表达质粒能有效转染L-02细胞,并在培养上清及细胞沉淀中检测到脂联素蛋白,该重组蛋白能够降低高糖处理的L-02细胞的血糖水平。结论:重组人脂联素蛋白能在L-02中有效表达,该蛋白定位在细胞质,并且能分泌到胞外,表达产物经体外实验证实具有生物学活性。     

肝水解肽体外活性测定方法的探讨研究

目的:建立肝水解肽体外生物学活性测定方法。方法:将不同浓度肝水解肽作用于正常人肝L02细胞,WST-8比色法测定L02细胞增殖情况。同时对实验条件,包括稀释液、细胞接种密度、药物作用时间等进行探讨,建立肝水解肽体外活性测定方法,并用该方法对2个厂家生产的2批产品进行活性检测。结果:获得了比较稳定可靠的实验参数:稀释液为RPMI-1640培养液,细胞接种密度为4.0×104个.mL-1,药物作用时间为48～72 h,肝水解肽浓度为0.5,0.25,0.12,0.06,0.03,0.015 mg.mL-1。由这些实验参数建立了肝水解肽活性测定方法。用该方法检测的2批产品活性均合格,重复实验3次,每次实验结果均一致,RSD均低于10%。结论:该方法可用于肝水解肽体外生物学活性测定。     

融合蛋白技术及临床应用进展

融合蛋白的特点是表达不同蛋白的功能活性域,各组分的协同作用使融合蛋白性能被优化,甚至产生新的生物学活性.融合蛋白技术正在从基础研究走向临床应用,已经逐步成熟、完善并有所创新.新型多结构域的人工蛋白在诸多临床领域有潜在应用价值.本文对融合蛋白技术的主要内容、发展情况以及在DNA疫苗、多功能酶、定向药物、溶栓剂、抗菌肽、缺血-再灌注损伤的治疗方面的应用作一综述.     

新的红细胞生成刺激蛋白体内生物学活性检测(英文)

本文建立了一种新的红细胞生成刺激蛋白体内生物学活性测定方法。将新的红细胞生成刺激蛋白单剂量注射给小鼠后, 小鼠外周血网织红细胞含量随注射剂量增加而升高。在3.125 200 ng/只的剂量范围内, 外周血网织红细胞的含量与注射剂量呈很好地线性关系, 满足量-反应平行线法定量的要求。本文对方法的准确性、精密度、检测范围、采血时间等进行了研究。结果表明, 该方法准确、重现性好, 可用于新的红细胞生成刺激蛋白生物学活性检测。     

重组人白介素-1α生物学活性测定方法的建立

目的 建立并优化采用D10.G4.1细胞测定重组人白介素-1α(rhIL-1α)生物学活性的方法,并用于rhIL-1α样品的检测.方法 MTT法测定rhIL-1α促进D10.G4.1细胞增殖能力,从而反映rhIL-1α的生物学活性.结果 建立了D10.G4.1细胞增殖法测定rhIL-1d生物学活性的方法.优化后实验条件如下,样品稀释培养基:RPMI1640+10％ FBS+0.5％T-STIM with ConA +0.05mM2-巯基乙醇;样品上板浓度:10ng ·mL-1;细胞密度:4×105个/mL;培养时间:72h;样品梯度稀释倍数4倍.利用优化后的实验条件对rhIL-1α样品活性进行3次测定,评价方法的可重复性.结果 3次实验的变异系数为5.7％,符合方法的要求,表明方法重复性好.结论 建立了D10.G4.1细胞测定rhIL-1α生物学活性的方法,该方法操作简便,重复性好,可应用于rhIL-1α的生物学活性检测.