熔解曲线分析检测临床常见3种革兰阴性菌的方法建立

目的 构建熔解曲线分析法同时检测临床常见3种革兰阴性病原菌.方法 选取临床常见的铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌作为本课题研究的检测菌种.对目标菌种设计种特异性引物.构建熔解曲线法,并进行特异性验证.检测不同拷贝浓度稀释液进行敏感性分析.检测临床分离目标菌各20株,进行稳定性评价.结果 (1)特异性验证结果显示,目标菌种均有特异性熔解曲线,Tm值依次为88.37℃; 86.32℃; 80.86℃; (2)敏感性分析结果显示,3种目标菌可检测到的拷贝浓度稀释液依次为:1.34×103拷贝/ml,3.67×103拷贝/ml,3.01×103拷贝/ml; (3)稳定性评价的结果显示,3种目标菌其平均Tm值依次为88.54±0.662; 86.38±0.727;80.12±0.607.结论 所构建的熔解曲线法具有较好的特异性、敏感性和稳定性;并具有快速、简便、成本低廉的特点,可用于临床样本的检测.     

产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检测及其基因分析

目的了解临术分离菌中产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌发生率，分析其耐药表型，探讨其ESBLs基因类别。方法采用美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的纸片扩散法，对364株大肠埃希菌和71株肺炎克雷伯菌进行产ESBLs菌株初筛试验，并用双纸片确证试验和双纸片协同试验进行产ESBLs菌株确证。按照NCCLS文件标准，用Kirby-Bauer纸片扩散法进行产ESBLs株21种抗生素药敏试验。用PCR方法扩增168株ESBLs表型阳性菌中blaTEM-1、blaSHV-1、CTX-M-1组、TOHO-1组等4种基因。结果（1）大肠埃希菌和克雷伯菌中产ESBLs的检出率分别为46．7％和32．4％。（2）产ESBLs菌对青霉素类100％耐药；对第1、2代头孢菌素耐药率达85％～100％；对除头孢他定以外的第3代头孢菌素，产ESBLs大肠埃希菌耐药率为80％以上，产ESBLs肺炎克雷伯菌耐药率为65％～75％以上；产ESBLs菌对复方新诺明的耐药率为75％～85％；产ESBLs大肠埃希菌对环丙沙星耐药率为80％～90％、庆大霉素耐药率为50％～75％；产ESBLs菌对阿米卡星、头孢替坦、亚胺培南有较好的敏感性（80％～90％以上）。（3）产ES-BLs大肠埃希菌中，blaTEM-1、blasSHV-1、CTX-M-1组等3种基因扩增阳性率分别为93．9％、7．4％和53．4％。51．4％的菌株同时携带2种耐药基因，2．7％的菌株同时携带3种耐药基因。产ESBLs肺炎克雷伯菌中blatTEM-1、blaSHV-1、CTX-M-1组等3种基因扩增阳性率分别为50．0％、95．0％和20．0％。同时携带2种耐药基因的菌株占35．0%，同时携带3种耐药基因的菌株占15．0％。两种细菌中均未检出TOHO-1组基因。结论大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产ESBLs的检出率较高，大肠埃希菌中产ESBLs菌比例有逐年上升趋势。产ESBLs菌对头孢噻肟的耐药率远高于头孢他定，且多数菌株对青霉素类，第1、2、3代头孢菌素、喹诺酮类、磺胺类、氨基糖甙类等抗生素呈多重耐药。大肠埃希菌中以TEM型和CTX-M型基因为主。肺炎克雷伯菌以SHV型基因为主，同时存在TEM型和CTX-M型基因。     

体外诱导脂肪源性干细胞向类肝细胞的定向分化

背景：用脂肪源性干细胞治疗肝脏疾病之前,如何建立有效稳定的肝细胞分化诱导方案,纯化并快速扩增性能稳定的类肝细胞等问题亟待解决。 目的：建立大鼠脂肪源性干细胞转化为类肝细胞的程序化诱导体系。 方法：分离纯化Lewis大鼠脂肪源性干细胞,流式细胞仪鉴定其表面标志,分3个阶段加入含有肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4、酸性成纤维细胞生长因子、制瘤素M细胞因子的诱导培养体系,使脂肪源性干细胞向肝细胞转化。 结果与结论：大鼠脂肪源性干细胞诱导7,14,21 d后,细胞阳性表达 ALB、AFP、CK18mRNA,表达量随诱导时间延长而增强,类肝细胞具有白蛋白合成功能。氨代谢和尿素的合成功能在9~12 d出现并持续存在。结果表明脂肪源性干细胞体外分段诱导可成功转化为类肝细胞。     

3种方法对临床菌血症样本细菌DNA提取的比较

目的寻找一种简单、有效的提取临床菌血症样本细菌DNA的方法．方法分别用碱液加热裂解法、溶菌酶法和商品DNA提取液法提取细菌DNA,用临床常见病原菌特异性引物,进行PCR扩增．结果（1）商品DNA提取液法提取革兰阴性菌DNA,经PCR扩增后得到特异性目的片段,但未扩增出革兰阳性菌的特异性目的片段;（2）碱液加热裂解法、溶菌酶法提取革兰阴、阳性菌DNA,经PCR扩增后均得到特异性目的片段,但碱液加热裂解法比溶菌酶法能扩增到更低浓度的细菌DNA目的片段．结论碱液加热裂解法是3种方法中最简单有效的细菌DNA提取方法,适用于临床病原菌基因组DNA提取．     

熔解曲线分析检测临床常见5种革兰阴性菌的方法建立

目的:构建熔解曲线分析法检测5种临床常见革兰阴性病原菌.方法:选取临床最常见的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽单胞菌作为目标检测菌种.对目标菌种设计种特异性引物.构建熔解曲线法,并进行特异性验证.检测不同拷贝浓度稀释液进行敏感性分析.检测临床分离目标菌各20株,进行稳定性评价.结果:(1)经预实验后,对Tm值差异较大的铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌三对引物同时进行熔解曲线分析,对大肠埃希菌、嗜麦芽单胞菌两对引物同时进行熔解曲线分析.(2)特异性验证显示,目标菌种均有特异性的熔解曲线,各自的Tm值依次为88.37、86.32、80.86和87.56、86.32℃.(3)可检测到的拷贝浓度稀释液约为3.0 × 103 copies/mL.(4)稳定性评价的结果显示,Tm值变化范围窄小,差异有统计学意义.结论:所构建的熔解曲线法具有较好的特异性、敏感性和稳定性.     

体外诱导脂肪源性干细胞向类肝细胞的定向分化

背景：用脂肪源性干细胞治疗肝脏疾病之前,如何建立有效稳定的肝细胞分化诱导方案,纯化并快速扩增性能稳定的类肝细胞等问题亟待解决。 目的：建立大鼠脂肪源性干细胞转化为类肝细胞的程序化诱导体系。 方法：分离纯化Lewis大鼠脂肪源性干细胞,流式细胞仪鉴定其表面标志,分3个阶段加入含有肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4、酸性成纤维细胞生长因子、制瘤素M细胞因子的诱导培养体系,使脂肪源性干细胞向肝细胞转化。 结果与结论：大鼠脂肪源性干细胞诱导7,14,21 d后,细胞阳性表达 ALB、AFP、CK18mRNA,表达量随诱导时间延长而增强,类肝细胞具有白蛋白合成功能。氨代谢和尿素的合成功能在9~12 d出现并持续存在。结果表明脂肪源性干细胞体外分段诱导可成功转化为类肝细胞。     

云南汉族RAS系统基因多态性与高血压病的相关性研究

目的探讨中AGT、ACE基因多态性与高血压病的相关性。方法采用病例-对照相关性研究策略,选择三代居住云南的汉族作为研究对象,用基因芯片检测技术,对100例高血压病患者及97例健康对照者进行AGT M235T(MM、MT、TT)、ACEI/D(Ⅱ、ID、DD)位点基因多态性检测。用Odd Ratio估计相对危险度。结果1、云南汉族97例健康人群中(1)AGT M235T位点的MM、MT、TT基因型频率分别是0.052、0.381、0.567;M和T的等位基因频率分别是0.242、0.758。(2)ACEI/D突变的Ⅱ、ID、DD基因型频率分别为0.340、0.598、0.062;I和D等位基因频率分别是0.680、0.320。2、云南汉族100例高血压病患者中,AGT M235T(MM、MT、TT)、ACEI/D(Ⅱ、ID、DD)位点的基因型多态性频率与对照组比较,差异无显著性意义。结论云南汉族健康人群AGT M235T、ACEI/D基因多态性可能在高血压病发生中不起直接作用。     

昆明地区原因不明复发性流产妇女与HLA—G14bp基因多态性相关性研究

目的探讨人类白细胞抗原G（human leukocyte antigen，HLA）3’非编码区（UTR）14bp基因多态性与原因不明复发性自然流产的相关性。方法对原因不明复发性流产患者26例和正常妊娠妇女51例静脉采血，提取DNA。用PCR方法检测HLA—G 14bp基因多态性。结果-14bp／-14bp缺失纯合子、＋14bp／＋14bp插入纯合子、-14bp／＋14bp缺失／插入杂合子基因型在两组间分布差异无显著意义；一14bp和＋14bp等位基因频率在两组间也无显著型差异。结论昆明地区部分原因不明复发性流产患者的病因与HLA—G 14bp基因多态性可能无直接相关性。     

产ESBLs大肠埃希菌CTX—M型耐药基因分析

目的了解某院CTX-M型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）在大肠埃希菌中的检出率，并确定其基因型。方法对该院2005年1—12月临床送检标本中分离的197株大肠埃希菌进行ESBLs表型确证试验和接合试验；采用聚合酶链反应（PCR）检测CTX-M酶基因型，对PCR产物测序并确定其基因型。结果197株大肠埃希菌中有104株（52．79％）ESBLs表型检测阳性，其中91株符合供体菌标准，64株（70．33％）接合成功，接合子均确证产ESBLS。PCR扩增结果示104株产ESBLs大肠埃希菌中共有98株（94．23％）携带CTX-M型基因，其中38株（36．54％）检出blaCTX-M-1组基因，69株（66．35％）检出blaCTX-M-9组基因。64株接合子中共有51株（79．69％）携带CTX-M型基因，其中18株（28．13％）检出blaCTX-M-1组基因，35株（54．69％）检出blaCTX-M-9组基因。基因测序确定存在CTX-M-22、CTX-M-28、CTX-M-15、CTX-M-14、CTX-M-27五种基因亚型，以CTX-M-14为主。结论该院大肠埃希菌产ESBLs和耐药质粒水平传播情况严重，产ESBLs细菌基因型以CTX-M-9组的CTX-M-14亚型为主，同时存在CTX-M-22、CTX-M-28、CTX-M-15和CTX-M-27等多种亚型。