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相似文献
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1.
目的为了简便、快速的提取混合病原菌的基因组DNA,进而获得不同病原菌的特异性毒力DNA片断用于进一步的基因诊断。方法改良了裂解试剂,同时提取革兰氏阳性菌(以金黄色葡萄球菌为代表)和革兰氏阴性菌(以产毒性大肠杆菌ETEC为代表)的混合基因组DNA;采用双重PCR法进行扩增鉴定。结果提取得到混合菌的混合基因组,并以此为模板通过双重PCR同时扩增得到两种菌的特异性DNA片断。结论这是一种合并提取混合菌基因组DNA,进而获得不同病原菌DNA片段的简便方法。  相似文献   

2.
目的 改进一种以含蛋白酶K的裂解液作用于石蜡包埋处理的细胞、分离DNA粗提液用于PCR扩增的实验方案。方法 石蜡包埋组织切片经常规脱蜡处理,用蛋白酶K裂解液洗脱细胞,55 ℃消化3 h后离心,吸取上清液;分光光度法检测DNA酶裂解液质量和浓度;以之为模板分别扩增人线粒体基因微卫星多态D310区、ATPase6基因区和核基因HBB、BRCA1等的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR扩增情况,并测序验证扩增产物。结果 以石蜡切片的DNA裂解粗提液为模板,扩增目的DNA片段阳性率可达100%;获得序列分析验证。结论 改进的蛋白酶K裂解液一步洗脱消化法操作简单、过程快捷、费用低廉,能快速有效地分离石蜡组织切片DNA,用于后续PCR扩增检测,具有较高效率。  相似文献   

3.
目的 比较两种提取冰冻全血基因组DNA的方法,即分离白细胞法和裂解红细胞法所获得基因组DNA的质量。方法 分别测定所获DNA的效率和纯度,同时,笔者用PCR/SNP敏感性分子开关技术。对两种方法获得的模板DNA进行单核苷酸多态性(single—nucleotide polymorphism,SNP)分析。结果 结果显示分离白细胞法DNA产量与纯度均高,裂解红细胞法获得的DNA产量、纯度相对较低;PCR/SNP敏感性分子开关检测表明:分离白细胞法和裂解红细胞法制备的DNA模板,均可在体外进行有效的PCR扩增。但分离白细胞法获得的目的DNA带特异性凸显,而裂解红细胞法获得的目的带特异性相对较差。结论 预先分离纯化白细胞是从冰冻全血中获得较高纯度DNA和有效提高DNA产量的重要操作步骤。  相似文献   

4.
多重半套式PCR检测细菌16srRNA基因方法的建立   总被引:1,自引:0,他引:1  
(1)目的 设计并建立多重半套式聚合酶链反应(PCR)快速检测临床标本中感染病原菌DNA方法。(2)方法 通过对多数病原菌16srRNA基因保守区和变异区序列分析,设计通用引物和革兰阴性菌及革兰阳性菌的特异性引物分别作为外侧和内侧引物,分两步先后加入同一反应体系中对不同细菌的DNA进行扩增。(3)结果金黄色葡萄球菌和大肠无纪律希菌经扩增后均有长度为1032bp的DNA片段产生;金黄色葡萄球菌另有一长度为336bp的特异性产物,大肠埃希菌另有一长度为127bp的特异性产物。(4)结论 该方法可以特异、敏感、快速检测出临床感染的病原菌。  相似文献   

5.
几种水稻田土壤微生物总DNA提取方法的比较   总被引:9,自引:0,他引:9  
目的:使人们在提取土壤总DNA时,可以根据不同的要求选用不同的方法。方法:选用了5种现在较常用的土壤微生物总DNA提取方法从水稻田土壤中提取总DNA,并对5种方法提取的DNA的质量和数量进行比较评价。结果:5种方法都可以从土壤中提取到长度大于48kb的DNA片段,但不同方法提取的DNA的产量存在明显差异。土壤总DNA都不需要纯化就可以用于PCR扩增,使用细菌16SrDNA基因的引物可以扩增得到相应的片段。结论:Bourrain法和Martin-Laurent法可以较快地提取出DNA,Martin-Laurent法提取的DNA的量最多,Tiedje法和Janssen法提取的DNA片段最大,Janssen法提取的DNA纯度最高,Reddy法提取的DNA的完整性和PCR扩增效果最好。  相似文献   

6.
目的探讨聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)与DNA测序技术鉴定脓肿分枝杆菌的效果。方法利用细菌16S r RNA基因通用引物PCR扩增疑似分枝杆菌的16S r RNA基因的DNA片段并进行DNA测序分析。DNA测序获得序列经生物信息学比对分析获得相关分枝杆菌的信息;针对相关分枝杆菌分别设计非同源区域特异性引物对1 500 bp的克隆DNA片段扩增验证。结果细菌16S r RNA基因通用引物扩增获得约1 500 bp的DNA片段,但DNA测序仅获得其中部分DNA序列约296 bp;部分DNA序列经生物信息学比对分析后获得四种同源性高达98%的分枝杆菌信息,并且四种分枝杆菌的特异性引物对1 500 bp的克隆产物进行扩增后仅在脓肿分枝杆菌中获得特异性PCR产物。结论疑似结核患者体内的抗酸染色阳性菌为非结核分枝杆菌中的脓肿结核分枝杆菌,并且PCR直接测序法可快速鉴定细菌的种属。  相似文献   

7.
朱伟锋  刘卓琦  吴金兰  余乐涵  万福生 《重庆医学》2012,41(8):764-765,768,724
目的建立一种快速的从口腔拭子中提取DNA的方法,研究其在尼古丁乙酰胆碱受体α3(CHRNA3)基因多态性分析中的应用。方法以NaOH和乙二胺四乙酸(EDTA)配制碱裂解液,以三羟甲基氨基甲烷-EDTA(TE)为中和液,经加热裂解和中和两步提取口腔拭子DNA。以提取的DNA为模板,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析对CHRNA3基因的rs6495309进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果 PCR扩增和酶切的靶带清晰,无非特异性条带。酶切结果与测序结果吻合。结论碱裂解法提取口腔拭子DNA具有快速、简便、经济、可靠的特点,可以用于CHRNA3基因多态性的分析。  相似文献   

8.
目的应用简便方法提取口腔拭子中DNA,并用特异引物扩增,评估该方法的应用价值。方法用1×PCR缓冲液、MgCl2及蛋白酶K混合裂解液在PCR仪上对口腔拭子进行消化,并以该产物为模板,应用角蛋白5基因1号外显子及1号染色体上2个微卫星标记特异性引物扩增,目的片段分别用于测序和毛细管电泳。结果通过上述方法可获得用于PCR反应及后续基因测序及微卫星标记毛细管电泳分型的足量DNA。结论利用PCR缓冲液、MgCl2及蛋白酶K混合裂解液从口腔拭子中提取DNA是一种简单、高效、快速、低成本的方法,更是一种无创的采样方法。  相似文献   

9.
目的:建立一种简易的金黄色葡萄球菌DNA提取方法。方法:用4种不同的细菌DNA提取方法提取金黄色葡萄球菌DNA,用琼脂糖凝胶电泳及PCR检测提取物并比较结果。结果和结论:溶菌酶能有效的降解金黄色葡萄球菌细胞壁,且用溶菌酶破壁后提取的DNA适于PCR实验,本研究成功的得到一种简易的、改良的金黄色葡萄球菌DNA的提取方法。  相似文献   

10.
一种提取肠道细菌总基因组DNA的方法   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:尝试提取人体肠道菌群总DNA,为研究肠道菌群结构提供依据。方法:以人体粪便为样本,使用PBS多次清洗,离心样品,沉淀粪便中的菌体。使用裂解液、溶菌酶和蛋白酶K等裂解菌体,用酚/氯仿方法抽提DNA,以提取到的肠道细菌总DNA为模板进行ERIC-PCR扩增。结果:电泳显示样品DNA条带明亮,少数样品DNA存在降解现象;ERIC-PCR扩增得到较清晰的指纹图谱。结论:经改进后的方法操作简单、实用、经济,适用于肠道菌群结构的研究。  相似文献   

11.
PCR法从痰液中快速检测结核分枝杆菌   总被引:3,自引:2,他引:1  
目的:建立一种从痰液中检测结核分枝杆菌简便,快速且灵敏的方法。方法;用碱液化,水洗和Triton X-100热裂解法从痰液中制备结核分枝杆菌DNA,进行PCR反应,并将该方法同其它几种方法进行比较。结果:该方法同抗酸性染色镜检法有显差异,同酚/氯仿法具有的灵敏度,结论:用该方法从痰液中检测结核分枝杆菌具有灵敏,简便和快速等特点。  相似文献   

12.
外周血基因组DNA提取方法比较   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的建立快速经济有效提取微量外周血基因组DNA的方法。方法采用酚/氯仿提取法、NaCL沉淀法和试剂盒法,直接从人外周血中提取基因组DNA,并以此为模板,进行肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因片段的扩增及鉴定。结果酚/氯仿法和试剂盒法提取的DNA量大,需血量少,用于PCR扩增结果稳定。结论酚/氯仿提取外周血DNA稳定、高效、经济,可用于批量临床标本的制备。  相似文献   

13.
全血基因组DNA的提取和纯化方法比较   总被引:8,自引:0,他引:8  
目的探讨全血基因组DNA的快速纯化方法。方法分别采用表面活性剂裂解法、传统酚抽提法、加热法分别制备DNA,分析各种方法提取DNA的产量、纯度,以及方法本身的优缺点、费用等,同时我们进行RAPD标记实验以比较纯化的DNA在PCR上应用的效果。结果表面活性剂裂解法简单快速,其制备的DNA产率、纯度明显高于传统酚抽提法,但其完整性不如后者。加热法快速制备的全血基因组DNA作为模板虽然纯度差,但仍可用于PCR,并得到满意的检测结果。同一份标本采用不同方法提取的DNA作为模板进行的RAPD标记实验,其多重PCR产物进行分离产生的DNA图谱基本一致。结论3种全血DNA纯化方法均可满足不同的实验要求。  相似文献   

14.
目的:探讨从石蜡包埋组织标本获取线粒体DNA(mtDNA)并进行PCR扩增的有效方法。方法:选取27例石蜡包埋的淋巴瘤组织,分别使用二甲苯/乙醇和0.5%Tween-20进行脱蜡,改进裂解缓冲液的成分及浓度,酚/氯仿抽提以获取mtDNA并进行电泳和PCR分析。结果:0.5%Tween-20法获取mtDNA纯度及浓度含量明显高于二甲苯/乙醇法(P〈0.01);二甲苯/乙醇法和0.5%Tween-20法获取的mtDNA PCR扩增成功率分别为11.1%和40.7%,两者差异有统计学意义(P〈0.05)。结论:二甲苯/乙醇和0.5%Tween-20两种方法都可以扩增出mtDNA的目的片段,但0.5%Tween-20法操作简便,PCR扩增成功率高,不用接触二甲苯等有毒化学试剂,是一种较为理想的mtDNA提纯方法。  相似文献   

15.
目的:比较水煮法和干血滤纸片基因组DNA分离试剂盒提取间日疟原虫DNA用于PCR检测及克隆研究的差异。方法:采集间日疟患者末梢血制备干血滤纸片,分别用水煮法和QIAamp DNAmini kit试剂盒提取间日疟原虫基因组DNA10份。PCR扩增LDH基因,并克隆质粒pGEM-PvLDH。分析比较2种提取方法的差异。结果:水煮法和试剂盒法提取的间日疟原虫gDNA,均扩增出LDH基因特异条带,但试剂盒提取的gDNA目的条带亮于水煮法。结论:水煮法操作简便、快速、经济,在等量血源条件下,所得DNA量较少、纯度较低;试剂盒提取可获得较高的得率,在定量检测和复合扩增时受到的影响因素较少,成功率较高。  相似文献   

16.
目的:探讨磁珠法提取基因组DNA的影响因素,建立快速、高效、批量提取全血基因组DNA的优化方案。方法:使用磁珠法核酸自动提取系统从全血中提取基因组DNA,紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。采用正交试验设计分析裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个因素的主效应和全血量与裂解时间、磁珠量,裂解时间与磁珠量的二阶交互作用对所提取DNA浓度和纯度的影响。结果:裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个主效应对DNA浓度的影响均存在统计学差异(P<0.05),当裂解时间为15 min,全血量为100μl,磁珠量为80μl,乙醇浓度为80%时,DNA平均浓度最高。磁珠量、裂解时间和全血量的交互作用对DNA OD260/OD280的比值有影响(P=0.008和P=0.013)。当磁珠量为40μl,裂解时间为15 min,全血量为100μl时,OD260/OD280的比值较好。磁珠量和乙醇浓度影响DNA OD260/OD230的比值(P=0.017和P<0.05),磁珠量为40μl,乙醇浓度为80%时,OD260/OD230的比值更好。结论:当DNA得率优先考虑时,可以选择裂解时间15 min、全血量100μl、磁珠量80μl、乙醇浓度80%的提取条件;而对DNA纯度要求较高时,可以将磁珠量改为40μl,以获得最优DNA提取效果。  相似文献   

17.
天麻总DNA提取及聚合酶链反应扩增鉴定   总被引:5,自引:1,他引:5  
目的:改良常用的植物DNA提取的CTAB,SDS法,以有效去除天麻多糖类杂质。方法:用CTAB法提取天麻鲜品不同部位(块茎、花序轴和胚芽)DNA;用生理盐水浸泡天麻干品之后,在应用CTAB,SDS法提取天麻干品的DNA;通过已知序列的天麻抗真菌蛋白基因片段的聚合酶链反应(PCR)扩增和PCR产物测序鉴定天麻DNA及其质量。结果:提取了44份天麻样本DNA,用CTAB法提取天麻鲜品不同部位的DNA,成功地用于PCR扩增,并通过DNA测序进一步鉴定;应用改良的CTAB,SDS法提取天麻干品DNA可用于PCR扩增,但DNA测序未成功。结论:用CTAB法提取的天麻鲜品各个部位DNA均可用于基因分析,而用天麻胚芽提取DNA的效果最理想;改良CTAB法能有效提取天麻干品DNA。提取的DNA可用于基因扩增。  相似文献   

18.
目的:比较三种不同方法提取人非抗凝血块基因组DNA的效果差异。方法:分别采用酚/氯仿法,天根试剂盒,Invitrigen purelinkTM试剂盒提取冻存时间较长的非抗凝血块基因组DNA,测定浓度、OD260/280值,琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA浓度和纯度,测定PCR产物灰度值。结果:三种方法都可以提取出基因组DNA,测定DNA浓度分别为:(35.56±15.27)ng/μL,(45.13±16.54)ng/μL,(57.93±14.5)ng/μL,组间存在统计学差异(P<0.01),A260/A280值分别为:1.46±0.19,1.49±0.16,1.519±0.23,三组间比较差异无统计学意义(P>0.05);三种方法提取的基因组DNA都能通过PCR扩增出目的条带,PCR产物电泳灰度值结果分别为:75.421±3.435,149.32±6.875和229.52±19.55,组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:三种不同方法都能提取出冻存时间较长的非抗凝血块基因组DNA,但Invitrigen purelinkTM试剂盒法效果最好。  相似文献   

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