肠道病毒71型感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的miRNA表达谱

目的 研究肠道病毒71型(EV71)感染神经细胞的miRNA表达谱,探讨miRNA在病毒感染神经细胞中的可能作用.方法 建立EV71感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)模型,收集感染后48 h细胞.以Taqman低密度芯片检测miRNA表达谱,使用实时RT-PCR对芯片结果进行验证并在TargetScan和miRanda网站预测靶基因,采用GO和KEGG分析靶基因功能.结果 成功建立EV71感染SH-SY5Y细胞模型,通过低密度芯片筛选出215种显著升高的miRNA和25种显著下调的miRNA.经过RT-PCR验证,3种miRNA(MiR-10a*、miR-15b*和miR-195)显著下调,7种miRNA(miR-10a、miR-342-5p、miR-483-5p、Let-7b、miR-99a、miR-140-5p和miR-21)显著上调,与芯片结果相符.GO分析显示发展进程和信号调节条目最富集靶基因.KEGG路径分析显示靶基因在肿瘤路径、蛋白水解、Wnt信号传导、黑素形成、粘附连接、MAPK信号通道最富集.结论 EV71感染神经细胞48 h后miRNA表达谱发生改变,10种变化的miRNA靶基因预测在发展进程、信号传导及凋亡中起着重要的作用,可为后期机制研究提供参考.     

含H5N1禽流感病毒核酸序列的病毒样颗粒的制备及应用

目的构建耐RNase酶的内含禽流感病毒H5N1亚型部分核酸序列的病毒样颗粒。方法构建中间载体pET32a-MS2,将禽流感病毒H5N1亚型的HA、NA和M基因片断连接到中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA和pET32a-MS2-M,分别转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒。结果表达载体经PCR、酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。电镜观察到了病毒样颗粒,荧光定量RT-PCR试验表明颗粒稳定性良好。结论成功构建了含禽流感病毒H5N1部分核酸序列的病毒样颗粒且稳定性良好,可作为禽流感H5N1亚型RNA检测的标准品和质控品。     

流感及H5N1亚型禽流感病毒液相检测芯片的制备

目的 建立利用液相芯片技术检测甲、乙型流感和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的方法,并对该方法进行评价。方法 对GenBank中甲型流感病毒的NP、乙型流感病毒的HA以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因片段序列进行同源性比对,根据保守序列,设计针对各基因的简并引物和寡核苷酸探针,制备探针偶联微球,将样本核酸多重PCR扩增产物与微球进行杂交,以Bio-Plex液相芯片检测系统进行芯片检测。结果 该方法可以对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因同时进行检测,病毒核酸的最低检出量为1pg,检测特异性高。结论 成功构建了甲、乙型流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒液相芯片检测系统,为流感、禽流感的快速检测、诊断奠定了基础。     

含甲型H1N1流感病毒HA基因序列病毒样颗粒的制备

[目的]构建耐RNase酶的内含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒。[方法]构建中间载体pET32a-MS2,将甲型H1N1流感病毒的HA基因片段连接中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒,对病毒样颗粒进行荧光定量RT-PCR检测和稳定性实验。[结果]表达载体经PCR、酶切鉴定分析后证实构建成功,荧光定量RT-PCR实验表明该病毒颗粒含有HA基因片段并且颗粒稳定性良好。[结论]成功构建了含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒且稳定性良好,有望作为甲型H1N1流感病毒RNA检测的标准品和质控品。     

重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。     

血清/血浆microRNA及其应用

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)在生物体的生长、发育及疾病的发生发展等过程中起着十分重要的作用.目前,人们关注的主要是miRNA在组织细胞内的功能.然而,最近的研究发现血清/血浆中存在一些循环的miRNA,血清/血浆miRNA在肿瘤、糖尿病等多种疾病中呈特异性表达,提示血清miRNA可作为潜在的生物标记物用于疾病的诊断和治疗.     

EV71型手足口病患儿血清Th1/Th2细胞因子水平分析

目的探讨EV71病毒感染所致手足口病患儿血清Th1/Th2细胞因子水平的变化。方法运用BD流式液相多重蛋白定量技术,检测EV71型手足口病患儿(病例组)和健康儿童(对照组)血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α及IFN-γ的水平。结果收集病例组和对照组样本各30例;病例组、对照组血清IL-6水平P50分别为7.0、1.9pg/ml,IL-10水平P50分别为3.4、2.4pg/ml,两组IL-6、IL-10水平比较差异均有统计学意义(P<0.05);而血清IL-2、IL-4、TNF-α及IFN-γ水平两组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 IL-6和IL-10可能参与了EV71病毒的致病机理。     

逆转录-环介导等温扩增技术结合横向流动试纸条法快速检测肠道病毒

目的建立一种快速特异敏感的肠道病毒检测方法。方法针对肠道病毒保守区基因序列,设计6条逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)特异性引物,经过优化,用毛细管电泳及横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物,建立RT-LAMPLFD检测方法,并与荧光定量PCR法进行比较。结果 LFD与毛细管电泳法检测特异的RT-LAMP扩增产物具有同样的敏感度,RT-LAMP-LFD法检测肠道病毒与其他病毒无交叉反应,最低检出限为10拷贝RNA分子,与荧光定量PCR法检测结果一致性为99.2%。结论建立的RT-LAMP-LFD方法,具有较高的特异性及灵敏度,操作简单、快速且不需要昂贵的仪器设备,适合应用于基层实验室肠道病毒的快速检测。