肠道病毒71型感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的miRNA表达谱

目的 研究肠道病毒71型(EV71)感染神经细胞的miRNA表达谱,探讨miRNA在病毒感染神经细胞中的可能作用.方法 建立EV71感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)模型,收集感染后48 h细胞.以Taqman低密度芯片检测miRNA表达谱,使用实时RT-PCR对芯片结果进行验证并在TargetScan和miRanda网站预测靶基因,采用GO和KEGG分析靶基因功能.结果 成功建立EV71感染SH-SY5Y细胞模型,通过低密度芯片筛选出215种显著升高的miRNA和25种显著下调的miRNA.经过RT-PCR验证,3种miRNA(MiR-10a*、miR-15b*和miR-195)显著下调,7种miRNA(miR-10a、miR-342-5p、miR-483-5p、Let-7b、miR-99a、miR-140-5p和miR-21)显著上调,与芯片结果相符.GO分析显示发展进程和信号调节条目最富集靶基因.KEGG路径分析显示靶基因在肿瘤路径、蛋白水解、Wnt信号传导、黑素形成、粘附连接、MAPK信号通道最富集.结论 EV71感染神经细胞48 h后miRNA表达谱发生改变,10种变化的miRNA靶基因预测在发展进程、信号传导及凋亡中起着重要的作用,可为后期机制研究提供参考.     

含甲型H1N1流感病毒HA基因序列病毒样颗粒的制备

[目的]构建耐RNase酶的内含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒。[方法]构建中间载体pET32a-MS2,将甲型H1N1流感病毒的HA基因片段连接中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒,对病毒样颗粒进行荧光定量RT-PCR检测和稳定性实验。[结果]表达载体经PCR、酶切鉴定分析后证实构建成功,荧光定量RT-PCR实验表明该病毒颗粒含有HA基因片段并且颗粒稳定性良好。[结论]成功构建了含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒且稳定性良好,有望作为甲型H1N1流感病毒RNA检测的标准品和质控品。     

重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。     

血清/血浆microRNA及其应用

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)在生物体的生长、发育及疾病的发生发展等过程中起着十分重要的作用.目前,人们关注的主要是miRNA在组织细胞内的功能.然而,最近的研究发现血清/血浆中存在一些循环的miRNA,血清/血浆miRNA在肿瘤、糖尿病等多种疾病中呈特异性表达,提示血清miRNA可作为潜在的生物标记物用于疾病的诊断和治疗.     

逆转录-环介导等温扩增技术结合横向流动试纸条法快速检测肠道病毒

目的建立一种快速特异敏感的肠道病毒检测方法。方法针对肠道病毒保守区基因序列,设计6条逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)特异性引物,经过优化,用毛细管电泳及横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物,建立RT-LAMPLFD检测方法,并与荧光定量PCR法进行比较。结果 LFD与毛细管电泳法检测特异的RT-LAMP扩增产物具有同样的敏感度,RT-LAMP-LFD法检测肠道病毒与其他病毒无交叉反应,最低检出限为10拷贝RNA分子,与荧光定量PCR法检测结果一致性为99.2%。结论建立的RT-LAMP-LFD方法,具有较高的特异性及灵敏度,操作简单、快速且不需要昂贵的仪器设备,适合应用于基层实验室肠道病毒的快速检测。     

羊及其体表蜱中SFTSV的分离培养与全基因序列分析

目的调查2012年春季江苏省某县羊及其体表蜱中发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)感染情况,并对分离到的毒株进行全基因序列分析。方法采用荧光定量RT-PCR法对标本进行SFTSV核酸检测,所有阳性标本进行病毒分离并测序,序列结果用Lasergene和MEGA4软件进行拼接和分析。结果 7只羊和从羊体上采集的93只长角血蜱中,1只羊的血清和淋巴结SFTSV核酸检测呈阳性,附着于该羊体表的1只长角血蜱病毒核酸也呈阳性,通过病毒分离获得2株SFTSV毒株,JS2012-yang01(羊)和JS2012-pi01(蜱)。序列分析结果显示,JS2012-yang01和JS2012-pi01的L、M和S基因片段的核苷酸同源性分别为99.8%、99.8%、100.0%,氨基酸同源性分别为99.6%、99.6%、100.0%,进化树分析显示两株病毒处于同一亚分支。2株毒株与中国其他地区流行的SFTSV毒株核苷酸序列同源性介于95.9%⁹9.6%(L基因),94.7%99.6%(L基因),94.7%⁹9.5%(M基因)和95.0%99.5%(M基因)和95.0%⁹9.5%(S基因),与布尼亚病毒科白蛉病毒属其他毒株序列差异较大。结论该调查中分离自羊和蜱的SFTSV高度同源。蜱虫通过叮咬吸血,可能在SFTSV从动物到人的传播过程中起媒介作用。     

甲型H1N1（2009）流感流行后流感样病例呼吸道病原检测分析

目的：了解甲型H1N1（2009）流感流行后的流感样病例（ILI）中,除流感病毒外的相关病原分布,为ILI患者临床治疗、流行病学调查提供参考。方法：收集流感监测哨点医院393份ILI咽拭子标本提取核酸,应用实时荧光PCR方法进行20种相关病原比对检测,分析各病原的阳性率与构成比。结果：检测出阳性咽拭子标本51例,分属13种共计64株病原体,其中阳性率较高的为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、冠状病毒。另有13例为两种病原体混合感染,占阳性标本数的25.49%。结论：ILI的病原构成比较复杂,且存在混合感染,临床治疗与流行病学调查均应引起重视。     

重组酶聚合酶扩增结合横向流体试纸条快速检测人腺病毒CSCD

目的 建立一种快速、敏感的人腺病毒等温核酸扩增检测方法.方法 针对人腺病毒hexon基因保守区序列设计特异性重组酶聚合酶扩增（RPA）引物及探针、优化反应时间和温度、用横向流体试纸条（LFD）和毛细管电泳检测扩增产物,建立人腺病毒RPA-LFD快速检测方法,评价该方法的敏感度和特异性并与Real-time PCR法比较.结果 RPA-LFD方法检测人腺病毒的最低检出限为2拷贝DNA分子/反应,且与其他呼吸道病原无交叉反应,临床样本检测结果与Real-time PCR法一致性为100％.结论 建立的RPA-LFD方法具有敏感性、特异性高、快速且不需要昂贵的仪器设备等优点,为人腺病毒快速检测提供了新工具.     

江苏省发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒的核酸检测及全基因组序列分析

目的 对江苏省2010年发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)进行核酸检测并分析其全基因组序列.方法 用荧光定量PCR的方法对江苏省2010年SFTSV感染病例进行核酸检测,将所有阳性标本进行病毒分离,取8株代表性毒株测定其全基因组序列,序列结果用DNA Star和MEGA4软件进行分析.结果 33例发热伴血小板减少综合征疑似病例中,20例SFTSV核酸检测阳性.1例狗标本SFTSV检测也为阳性.8株SFTSV毒株全基因组序列与国内其他地区流行株的序列高度同源,其中M片段核苷酸序列同源性介于95.8％～98.7％之间,氨基酸序列同源性介于98.7％～99.7％之间;而与汉坦病毒属和白蛉热病毒属的相关序列相比差异较大,M段核苷酸序列同源性最高仅为27.1％,氨基酸序列同源性最高仅为7.3％.与一代病例密切接触后发病的二代病例序列与一代病例序列完全一致;狗携带的SFTSV序列与病人序列高度同源.结论 SFTSV江苏株与国内参考株序列无明显差异,与布尼亚病毒科的其他属序列差异巨大;SFTSV存在人传人的可能性;狗可能是SFTSV的传播宿主之一.     

基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

目的建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法。方法针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件。用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法。进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较。结果以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应。RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918)。结论建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测。