实时荧光定量RT-PCR快速检测H7N9禽流感病毒

目的 构建一种灵敏、特异、快速的实时荧光定量RT-PCR反应体系用于临床H7N9禽流感疑似病例早期诊断及外环境H7N9病毒的监测.方法 以H7N9禽流感病毒H7基因和N9基因为靶基因设计引物以及TaqMan探针,并对引物、探针及反应条件进行优化,验证该反应体系检测的特异性、灵敏度、重复性和检测速度,然后与两种商品化试剂盒(试剂盒I和试剂盒Ⅱ)进行各项指标及184份现场样本作平行比对.结果 新建立的H7N9禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR反应体系呈典型的扩增曲线、扩增时间约50 min,H7基因与N9基因的最低检出限分别为28拷贝/μL与41拷贝/μL.重复性测定显示,H7和N9检测Ct值的变异系数(CV)分别为0.17％～0.89％和0.33％～0.59％,扩增效率分别为0.9491和0.9713;与其他常见禽流感病毒或肠道病毒无明显交叉反应.184份现场可疑样本阳性检出率为5.43％(10/184),与试剂盒Ⅱ结果一致.结论 本研究建立的实时荧光定量RT-PCR反应体系具有检测速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好、结果可靠等特点,可用于临床疑似病例的应急检测、早期诊断及养鸡场、活禽交易市场等外环境H7N9禽流感病毒监测.     

甲型H7N9流感病毒多重PCR-酶联免疫吸附检测方法的建立及应用

目的建立一种快捷灵敏的禽流感病毒PCR-ELISA检测技术。方法针对禽流感病毒M基因(M)、H7基因(H7)、N9基因(N9)3个基因片段的保守序列,通过生物素与地高辛的特异性标记,最后通过酶联免疫吸附反应判断PCR扩增的有无。结果M、H7、N9 3个基因片段所能检测的最低拷贝数分别为1.43×103copy/μl、1.04×102copy/μl、8.80×103copy/μl,其敏感度比普通PCR扩增提高了10倍~100倍,且不同流感病毒亚型之间、不同种属病毒之间均不存在交叉反应现象。另外还检测了114份临床标本,结果与鸡胚培养匹配率达100.0%。结论本文通过特异性和敏感性实验显示此方法灵敏度高、特异性强,且操作简单,可以广泛地应用于流感病毒的实验室检测。     

四重RT—PCR快速检测2013新型H7N9禽流感病毒

目的建立能快速准确检测发热病人咽拭子样本中2013新型H7N9禽流感病毒的四重RT—PCR方法。方法针对甲型流感病毒的M基因设计通用引物,针对2013新型H7N9禽流感病毒的HA和NA基因设计特异性引物,选择人源看家基因beta—aetin设计质控引物,通过优化实验条件建立一步法四重RT—PCR反应体系。与商品化实时荧光RT—PCR试剂盒进行方法比对。结果成功建立四重一步法RT—PCR筛查2013新型H7N9禽流感病毒的检测技术。结论该方法简便、实用、成本低廉,适用于2013新型H7N9禽流感病毒的快速检测。     

DPO引物多重RT-PCR技术检测甲型流感病毒的研究

目的应用DPO引物技术建立一种可以同时检测新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1、H3N2以及禽流感病毒H5N1的单管多重RT-PCR检测方法,为流行性感冒的监测与应急诊断提供高通量检测技术。方法应用DPO引物技术设计针对新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1和H3N2以及禽流感病毒H5N1的高特异性DPO引物,并对多重RT-PCR反应体系优化,建立多重RT-PCR检测技术。结果建立的多重RT-PCR方法可同时扩增新甲型流感病毒H1N1221 bp、季节性流感病毒H1N1468 bp和H3N2592 bp以及禽流感病毒H5N1350 bp的基因片段。检测敏感性分别为102、102、103和102copies/ml,并与呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒等呼吸道病毒无交叉反应。结论本研究建立的多重RT-PCR可以同时准确分型新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1和H3N2以及禽流感病毒H5N1,为流行性感冒的监测与应急诊断提供了有效的实验室检测手段。     

H7N9人禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

目的采用RT-LAMP技术建立一种针对H7N9人禽流感病毒的特异、灵敏、快速、可视、简便的检测方法。方法根据H7N9人禽流感病毒HA基因的保守序列,利用Primer Explorer V4软件,设计一套针对HA基因的7个区域的5条特异性引物,优化反应体系与扩增条件,并验证其特异度与灵敏度。结果该方法能检测出H7N9亚型流感病毒,而对H1亚型、H3亚型、H5亚型、H6亚型、H9亚型流感病毒、乙型流感病毒、人副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人冠状病毒、人偏肺病毒、人腺病毒、人博卡病毒均无扩增反应,其最低检出限为0.01 pg。另外,扩增反应只需要45 min即可判读结果,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化诊断。结论本研究建立的RT-LAMP检测方法具有高特异度、高灵敏度、快速简便、可视化判读结果等优势,适合在基层进行H7N9人禽流感病毒的快速检测,并可以应用于大流感疫情的准确筛查。     

禽流感病毒H5N1抗原基因克隆及体外转录

目的通过基因克隆和体外转录,获得H5N1禽流感病毒抗原基因的RNA全长片段,为病原学检测提供阳性定量标准品。方法设计H5N1禽流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)及基质蛋白M(M)的基因克隆引物,RT-PCR从病毒RNA获得相应片段,分别连接至pGEM-T Easy质粒并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,产物用DNase酶处理、纯化后测定浓度,RT-PCR验证。结果获得含H5N1禽流感病毒HA、NA、M全长基因序列的RNA片段,并可准确定量其拷贝数,质量浓度HA为503.9 ng/μL、NA为379.2 ng/μL、M为437.8 ng/μL。结论获得的RNA片段可作为H5N1禽流感病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。     

浙江省人感染H7N9禽流感病毒的基因组序列分析

目的分析浙江省2013年4月初一例人感染甲型H7N9禽流感患者的病原学和基因组序列特征.方法提取患者标本的病毒RNA并用荧光定量RT-PCR方法检测,一步法RT-PCR扩增H7N9禽流感病毒基因组的8个片段,测序并拼接出基因组序列.下载目前已经公布的H7N9禽流感病毒和其他H7、N9亚型的病毒的HA和NA序列,采用Mega 5.1软件对其进行序列比对并构建进化树.根据测序的结果分析该例H7N9禽流感病毒的序列变异情况.结果该患者标本甲型流感、H7亚型和N9亚型均为阳性,通过扩增基因组各片段并进行测序.对血凝素和神经氨酸酶基因进行比对和进化树构建,结果显示该H7N9病毒HA基因与A/duck/Zhejiang/12/2011(H7N3)的亲缘关系最近,NA基因与A/wild bird/Korea/A14/2011 (H7N9)的亲缘关系最近.编码内部蛋白的6个基因均与中国大陆近两年的H9N2毒株最为相似.该标本的病毒HA蛋白发生了Q226L突变,而与已经公布的人感染H7N9禽流感毒株均不一致的是PB2未发生E627K突变.结论从该份临床标本完成了检测和基因组各片段的扩增与测序.该病毒与已报道的人感染H7N9禽流感病毒同源性高,存在Q226L等重要位点的突变,但PB2未发生E627K突变.     

武汉市蔡甸区首例人感染H7N9禽流感病例流行病学调查

目的对蔡甸区首例人感染H7N9禽流感病例进行流行病学调查,为防控人禽流感提供参考。方法按照人感染H7N9禽流感疫情防控方案,对患者、可疑暴露者以及密切接触者展开调查。采集病人呼吸道标本用RT-PCR法检测H7N9禽流感病毒核酸,涉禽场所(含涉疫门店)外环境标本检测禽流感病毒核酸(H5、H7亚型)。结果患者发病前有活禽暴露史,呼吸道标本检测H7N9禽流感病毒核酸阳性;涉疫门店外环境标本禽流感病毒核酸阳性H7检出4/9,H5检出2/9。病人确诊后经定点医院抗病毒、给氧、抗感染和营养支持等治疗,病情控制、治愈出院;可疑暴露者2人、密切接触者6人经7d医学观察未见异常。结论冬春季是人感染H7N9禽流感流行期,应提高公众防病意识,继续强化活禽市场管理,建立长效机制,为人感染H7N9禽流感疫情的长远防控奠定基础。     

实时荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

目的 建立快速检测H5亚型禽流感病毒HA基因的实时荧光定量RT-PCR方法,为禽流感病毒的监测和感染的预防控制提供科学的技术手段.方法 针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与荧光探针;通过体外克隆技术获得阳性定量标准品;优化探针、引物浓度、反应体系与反应条件,提高检测方法的特异性、敏感性与重复性,并进行定量分析.结果 反应体系具有良好的扩增效率,80 min内可完成扩增检测工作;检测灵敏度为100拷贝/反应,通过外标准品建立的标准曲线在一条直线上;3个外标准品的变异系数(CV)分别为2.60％、2.47％、2.44％;H5亚型禽流感病毒培养液、确诊人感染高致病性禽流感患者标本为阳性扩增结果,而其它流感病毒临床标本及阴性对照均呈阴性.结论 本研究建立的实时荧光定量RT-PCR方法具有敏感、快速、重复性好的特点,适合于H5亚型禽流感病毒的快速定量检测.     

重组酶介导扩增方法快速检测黄热病毒

目的本研究采用重组酶介导的等温核酸扩增方法(RAA),通过使用逆转录酶,建立黄热病毒的一步法等温核酸扩增(RT-RAA)方法。方法根据黄热病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析RT-RAA的重复性、特异性、灵敏度;以所建立方法对黄热病毒样本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果黄热病毒RT-RAA扩增,体系中加入40 U的逆转录酶扩增效果最佳。该方法检测时间短(20 min),并且灵敏度高,检测下限可达100 copy,与登革病毒、西尼罗病毒、日本乙型脑炎病毒、基孔肯雅热病毒等蚊媒病毒无交叉反应,具有良好的特异性。结论构建的黄热病毒RT-RAA方法具有快速、特异以及灵敏的特点,适应于黄热病毒的口岸快速检测。