实时定量PCR检测骨髓增生异常综合征患者多个基因甲基化水平

Objective To analyze the promoter methylation levels of p15、 CDH1、 DAPK and HICI genes of patients with myelodysplastic syndrome (MDS) and explore the relationship between the level of methylation and clinical features. Methods DNA methylation levels of p15、CDH1 、DAPK and HICI in peripheral blood (PB) or bone marrow (BM) samples from 52 MDS patients were detected by real-time quantitative PCR. The correlation of the methylation level with clinical features and hematological findings was analyzed. 38 de novo AML patients and 46 normal individuals served as controls. Results The methylation levels of p15 、CDH1 、DAPK and HICI were 16.23 ± 21.69,6.59 ±9.39,0. 14 ±0. 11 and 7.81 ± 9.70 in BM,and 14.96 ± 20.16,6.00 ± 9.26,0.12 ± 0. 14 and 6.74 ± 9.72 in PB, respectively from 18 MDS patients,and the difference between BM and PB was not statistically significant (P ＞0.05). The methylation levels of p15 (14.70 ± 18.17) and CDH1 (6.61 ±8.79) genes in high risk (RAEB Ⅰ / Ⅱ) MDS were significantly higher than in low risk (RCMD/RARS/5q -, p15: 1.99 ± 1.59, CDH1: 1.23 ± 1.14 and RCMD, p15:3.02 ±3.42, CDH1:1.53 ±2.06) MDS or control (p15:1.69 ± 1.82, CDH1: 1.01 ± 1.12) (P ＜0.05).The methylation levels of DAPK gene had no difference among subtypes of MDS, and that of HIC1 gene only differed between RAEB Ⅰ / Ⅱ (9.16 ± 11.95) and control (2.49 ± 2.26) (P = 0. 042). The difference of methylation levels of p15 、CDH1 、DAPK and HICI in BM was statistically significant among subtypes of MDS (P=0. 001, 0. 003 ,0. 039,0. 023 , respectively). And so did of p15 and DAPK in PB (P=0. 013, 0.006,respectively). The methylation level of p15 and CDH1 was significantly correlated with IPSS classification and blasts percentage in BM. Conclusions p15 and CDH1 genes are special hepermethylation genes in MDS.Methylation level of HIC1 gene showed an upward tendency from low risk to high risk MDS.     

C5aR在慢性移植物抗宿主病中的表达及其作用机制

目的:探讨补体5a(C5a)及其受体(C5aR)在慢性移植物抗宿主病(cGVHD)中的表达及其作用机制。方法:用流式细胞术检测20例cGVHD患者及9例健康供者外周血淋巴细胞中C5aR的表达及CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞(Tregs)在CD4~+T细胞中的比例,并分析两者的相关性;将体外分离培养小鼠脾细胞分为对照组及重组小鼠C5a蛋白(rmC 5a)刺激组,用流式细胞术检测2组Tregs在CD4~+T细胞中的表达比例;另外,提取患者外周血单个核细胞进行体外培养,分为空白对照组及C5aR拮抗剂(C5aRA)组,用流式细胞术检测2组Tregs在CD4~+T细胞中的表达比例。结果:cGVHD患者外周血淋巴细胞表面C5aR的表达明显增多,而Tregs在CD4~+T细胞中的比例明显减少,两者呈显著负性相关(P0.05);体外培养小鼠脾细胞结果显示C5a下调Tregs在CD4~+T细胞中的比例;而体外培养患者外周血单个核细胞显示阻断C5aR可上调Tregs在CD4~+T细胞中的比例。结论:C5a/C5aR可能通过抑制Tregs的分化来介导cGVHD的发生发展。     

骨髓增生异常综合征患者地西他滨治疗后DNA甲基化水平变化

目的 了解骨髓增生异常综合征(MDS)患者地西他滨治疗后DNA甲基化水平的变化.方法 7例MDS患者难治性贫血伴原始细胞增多Ⅰ型或Ⅱ型(RAEBⅠ/Ⅱ)接受规律的地西他滨治疗,5天方案(4例)和3天方案(3例),每个疗程分4个时间点采集其外周血,实时荧光定量聚合酶链反应( real time-Q-PCR)方法检测外周血P15和CDH1基因的甲基化水平.结果 用药前3例患者(例2、例4和例7)P15甲基化水平较高(20％～65％),CDH1均较低(0.5％～5％).无论5天还是3天方案,用药前甲基化水平越高,用药后下降越明显,患者用药第5/7天后P15、CDH1甲基化水平下降幅度最大,达20％～60％,P15可维持在下降后的水平,在随后的治疗中未再出现明显的下降,但是CDH1的波动较大,用药期间CDH1甲基化水平可升至≥用药前水平.目前的数据表明甲基化的变化与血象变化不一致.应用重复测量方法分析5天与3天方案两个基因甲基化水平变化,两种不同方案组间去甲基化水平差异无统计学意义(均P ＞0.05);有血液学改善的患者与未改善患者的去甲基化程度差异无统计学意义.结论 地西他滨治疗后P15和CDH1的甲基化水平均有不同程度降低,但甲基化水平与治疗方案和疗效无关.     

丹参酮ⅡA磺酸钠对胰腺癌BX-PC-3细胞系增殖与细胞周期调控因子表达的影响

 目的：观察丹参酮ⅡA磺酸钠对胰腺癌细胞系BX-PC-3细胞增殖和细胞周期调控因子cyclin A、cyclin D2蛋白表达的影响。方法：分别用不同剂量的丹参酮ⅡA磺酸钠作用于胰腺癌细胞系BX-PC-3,应用MTT比色法检测培养48 h的细胞存活率, 应用流式细胞术测定培养48 h细胞周期的变化,Western blotting检测周期蛋白cyclin A和cyclin D2 的表达情况。结果：丹参酮ⅡA磺酸钠能明显抑制BX-PC-3细胞增殖,且具有明显的剂量依赖性;流式细胞术显示一定浓度药物作用细胞,可将细胞周期阻滞于G0/G1期;Western blotting检测发现药物能显著下调周期蛋白cyclin A和cyclin D2的表达水平。结论：丹参酮ⅡA磺酸钠能显著抑制人胰腺癌BX-PC-3细胞增殖,下调周期相关因子cyclin A和cyclin D2蛋白表达水平,这可能是丹参酮ⅡA磺酸钠抑制胰腺癌细胞生长增殖的作用机制。     

间充质干细胞诱导的CD8α~+ Jagged2~(high) CD11b~(high)调节性树突状细胞防治小鼠aGVHD

目的:观察间充质干细胞诱导的CD8α+Jagged2highCD11bhigh调节性树突状细胞(MSC-DCregs),对小鼠急性移植物抗宿主病(a GVHD)的影响。方法:体外诱导MSC-DCregs。以C57BL/6(H-2b)小鼠为供鼠、接受清髓性全身照射(TBI)预处理的BALB/c(H-2d)小鼠为受鼠进行移植。分为以下5组:为正常对照组;TBI组;移植组:移植物为1×107骨髓细胞(BMCs);a GVHD组:移植物为1×107BMCs+1×107脾细胞(Sp Cs);MSC-DCregs组:移植物为1×107BMCs+1×107Sp Cs+1×106MSC-DCregs。监测植入情况、H2-Kb嵌合率、a GVHD评分、生存和病理学改变。结果:处理1 0 d后所有小鼠造血恢复,30 d后嵌合率检测转为供鼠型。a GVHD组和MSC-DCregs组中位生存期分别为27 d和33 d,MSC-DCregs组生存期较a GVHD组延长(P0.01),临床评分比a GVHD组低(P0.01),33 d的皮肤、肝脏病理学改变均优于a GVHD组。结论:MSC-DCregs具有防治a GVHD的作用,其相关作用机理待进一步研究。     

γ干扰素联合脂多糖诱导人脐带间充质干细胞向MSC2极化

文题释义： γ干扰素联合脂多糖模拟炎症微环境：间充质干细胞的免疫抑制能力不是内在的,而是由促炎细胞因子诱导的。间充质干细胞暴露于炎症信号可显著增强其对T细胞、单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞的免疫抑制作用。γ干扰素由活化T细胞和NK细胞产生,激活抗原提呈细胞,上调转录因子T-bet 而促进Th1细胞分化;脂多糖是革兰阴性细菌细胞壁外壁的组成成分,是免疫反应的强烈刺激剂,具有通过信号转导途径促进各种炎性细胞因子分泌的作用。 间充质干细胞可极化为MSC1和MSC2两种类型：间充质干细胞既可以抑制免疫应答,也可以促进免疫应答,不同的炎症递质会诱导间充质干细胞极化分型并表现出截然相反的免疫调节作用,这一特性称为间充质干细胞免疫调节的可塑性。间充质干细胞可以通过下游Toll样受体信号极化成2种类型：MSC1和MSC2。文献报道Toll样受体4引发的MSC1主要发挥促炎功能,而Toll样受体3引发的MSC2主要发挥免疫抑制功能。 背景：间充质干细胞的免疫调节特性已被临床广泛应用于自身免疫性疾病和移植物抗宿主病,但是其免疫调节的可塑性导致间充质干细胞临床治疗效果出现异质性和不稳定性。 目的：探索γ干扰素联合脂多糖模拟炎症微环境诱导人脐带间充质干细胞向MSC2极化的作用。 方法：体外分离培养人脐带间充质干细胞,进行形态学、表面标志物、成脂及成骨诱导分化能力鉴定。分别用γ干扰素(10 μg/L)、脂多糖(100 μg/L)及二者联合刺激人脐带间充质干细胞24 h,与植物凝集素刺激的外周血单个核细胞直接共培养或Transwell间接共培养5 d。流式细胞术检测共培养不同时间点调节性T细胞和Th1细胞比例,荧光定量PCR检测人脐带间充质干细胞的Toll样受体2,3,4 mRNA表达水平。 结果与结论：①人脐带间充质干细胞呈梭形或成纤维形,高表达CD73、CD90、CD105,低表达CD34、CD45、HLA-DR;②在直接与间接共培养条件下,γ干扰素联合脂多糖刺激人脐带间充质干细胞均可增加调节性T细胞的比例,优于γ干扰素或脂多糖单独刺激组、未刺激组及外周血单个核细胞对照组(P < 0.05);③Th1细胞比例随共培养时间的延长呈逐渐下降的趋势;④在间接共培养的条件下,γ干扰素联合脂多糖刺激人脐带间充质干细胞更早向免疫抑制型MSC2极化,Toll样受体3表达显著增高(P < 0.05);⑤以上结果表明间接共培养体系下γ干扰素(10 μg/L)联合脂多糖(100 μg/L)是诱导人脐带间充质干细胞向MSC2极化的高效组合,并且MSC2的免疫抑制作用不依赖于细胞间的直接接触,为MSC2来源外泌体将来应用于临床研究奠定实验基础。 ORCID: 0000-0001-7335-2558(黄恬) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程