β-arrestin1过表达抑制Molt-4细胞异种移植小鼠急性T淋巴细胞白血病进展

目的 探讨β-arrestin1对Molt-4细胞异种移植急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）NCG小鼠模型疾病进展的影响。方法 建立稳定表达荧光素酶的人Molt-4细胞系,酶标仪检测其荧光素酶强度;构建稳定过表达或敲低β-arrestin1和空载体的Molt-4细胞系,设为β1组、Siβ1组和Scram组并分别接种于亚致死计量辐射后NCG小鼠体内;记录小鼠移植后体质量及生存时间;利用活体荧光成像系统检测移植小鼠模型体内肿瘤进展;移植后16 d处死小鼠,取肝和脾做切片染色,检测肿瘤细胞浸润。结果 成功构建稳定表达荧光素酶Molt-4细胞系（Molt4-Fluc）。在Molt4-Fluc基础上成功构建过表达β-arrestin1（β1）、敲低β-arrestin1（Siβ1）或空载体（Scram）的Molt-4细胞系。NCG小鼠T-ALL异种移植模型显示,β1组、Siβ1组及Scram组Molt4-Fluc细胞在受体NCG小鼠中进展,导致NCG小鼠在移植后体质量降低。小鼠生存时间显示,β1组细胞受体小鼠生存时间（43 d）显著长于Scram组细胞受体小鼠（33 d）,P<0.001;Siβ1组细胞受体小鼠生存时间（20 d）显著短于Scram组细胞受体小鼠（33 d）,P<0.001;活体荧光成像结果显示,β1组细胞受体小鼠体内T-ALL细胞荧光强度显著弱于Scram组细胞受体小鼠,Siβ1组细胞受体小鼠体内T-ALL细胞荧光强度强于Scram组细胞受体小鼠;处死移植后16 d小鼠,组织染色结果显示,β1组细胞受体小鼠肝、脾内肿瘤细胞浸润较Scram组细胞受体小鼠少。结论 β-arrestin1过表达可抑制Molt-4细胞异种移植后小鼠T-ALL进展。     

利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株

目的利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T（p.131G>V）突变位点的HEK293T细胞, 为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法针对G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点靶向设计4对向导RNA （sgRNA）,构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的 细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1（T7E1）酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测 G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变。结果成功构建基于G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的Cas9-sgRNA外 源PX458 质粒,T7E1 酶切检测四对sgRNA 的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%。测序鉴定敲除G6PD 基因 c.392G>T（p.131G>V）突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生 素K3诱导细胞死亡增加。结论本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的HEK293T稳定细胞模型, 为后期研究基因的修复奠定了基础。