中国人群肥厚型心肌病患者心肌肌钙蛋白T基因突变研究

目的初步探讨中国人群肥厚型心肌病患者心肌肌钙蛋白 T基因突变情况,为该病的早期防治和康复介入奠定理论基础. 方法提取 58例肥厚型心肌病( hypertrophic cardiomyopathy, HCM)患者外周血白细胞基因组 DNA,聚合酶链反应( PCR)扩增心肌肌钙蛋白 T( cTnT)基因 8、9、11号外显子,产物做单链构象多态性( SSCP)分析,出现异常条带者直接测序验证. 结果58例临床确诊的 HCM患者 cTnT基因 8, 9, 11号外显子,除 160位密码子存在 ATC和 ATT多态性外,未发现基因位点的异常. 结论与国外报道的肥厚型心肌病约 20%是由肌钙蛋白 T基因突变引起相比较,中国人群肥厚型心肌病患者基因突变可能存在不同的特点.     

寻找一种诊治心肌损伤的新方法：鼠抗人cTnI单抗Fab段基因克隆和序列分析

背景：为将鼠抗人cTnI单克隆抗体应用人体进行体内诊断或作为治疗心肌损伤的药物载体，必须降低鼠源性抗体的免疫源性，克服其人抗鼠抗体反应，需要对其进行人源化改造。目的：克隆鼠抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因并进行序列分析。设计：单一样本研究。单位：一所医科大学附属医院的心血管病研究所。材料：本实验于2003—01／2004—05在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。分泌鼠抗人cTnI单克隆抗体的杂交瘤细胞株(JS200202)由南京医科大学第一附属医院心血管病研究所提供。方法：设计扩增鼠IgG重链Fd段及K轻链引物，从分泌cTnI单抗的杂交瘤细胞中提取总RNA，RT-PCR扩增，对扩增产物进行分子克隆、测序及序列分析。主要观察指标：重链Fd段和K轻链基因序列及其所属亚型。结果：重链和轻链引物分别扩增出一约700bp和800bpDNA片段。经序列分析，与已发表的鼠IgG基因序列对比，其核苷酸及其所推导的氨基酸序列符合鼠IgG1 Fab段特征：在GenBank登录，登录号为AY484430(重链)，AY484431(轻链)；氨基酸序列登录号为AAR83243(重链)，AAR83244(轻链)。结论：本实验室获得了完整的鼠源性抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因，为鼠抗人cTnI单克隆抗体的人源化改造奠定了基础。     

钙调神经磷酸酶在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用

目的　探讨钙调神经磷酸酶 (CaN)在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用及抑制CaN活性对心肌肥厚的影响。方法　制备两肾一夹肾血管性高血压大鼠模型 ,术后 2月 ,经心脏超声证实大鼠心肌肥厚后 ,分别予环孢菌素A(CsA)或培多普利治疗。观察CsA、培多普利对大鼠心肌肥厚程度 ,CaNmRNA、蛋白质表达和CaN活性的影响。结果　两肾一夹术后 2月 ,手术组大鼠左室后壁和室间隔厚度均较假手术组增高 2 1 % (P <0 0 1 ) ,CsA治疗后较治疗前分别下降 1 6 %和 1 4 % (P <0 0 1 ) ,培多普利治疗后左室后壁和室间隔厚度亦较治疗前下降。同时大鼠左室心肌CaNmRNA和蛋白质表达、CaN活性均显著下降。结论　CaN参与肾血管性高血压大鼠心肌肥厚 ,抑制CaN活性可逆转心肌肥厚     

心肌肌钙蛋白I磷酸化及降解与肥厚型心肌病

目的：观察心肌肌钙蛋白I在肥厚型心肌病小鼠心肌组织中的磷酸化与降解作用。 方法：实验于2005-03／2006-01在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所及南京医科大学动物中心SPF级动物房进行。取4周龄BALB／c雌鼠12只，随机分为模型组6只，正常对照组6只，适应性饲养1周后模型组小鼠转染带有EGFP报告基因的CTnIArg146Trp突变基因。饲养至20周龄时二维超声心动图检测证实模型组小鼠室间隔肥厚，断颈处死两组小鼠后，称取小鼠心脏质量（湿），心尖部心肌组织光镜病理学检查，小鼠心肌组织进行Western Blotting检测重组蛋白、肌钙蛋白I的磷酸化及降解表达，GAPDH作为内参半定量。结果：12只小鼠进入结果分析。①模型组小鼠心脏明显增大，心脏质量（湿）／体质量比显著高于正常对照组（P〈0．01）；模型组小鼠心肌细胞肥大、排列紊乱、间质血管增生、少量炎性细胞浸润；两组血清肌钙蛋白I水平均正常（P〉0．05）。②模型组小鼠心肌组织用抗EGFP单克隆抗体在帆55000，24000检测到突变CTnI—EGFP及其降解片断表达。③模型组在M55000，30000，28000分别检测到磷酸化突变CTnI-EGFP、内源性肌钙蛋白I及其降解片断表达，正常对照组在Mr30000见磷酸化肌钙蛋白I表达，模型组内源性磷酸化肌钙蛋白I表达明显高于对照组（1．18&;#177;0．15，0．97&;#177;0．15,P〈0．05）。④去磷酸化抗肌钙蛋白I单克隆抗体在肛55000，28000，检测到去磷酸化突变肌钙蛋白I-EGFP、内源性肌钙蛋白I降解片断表达，正常对照组未见去磷酸化肌钙蛋白I表达；用针对不同位点的抗肌钙蛋白I单克隆抗体3E3，2I-14，8I-7，MF4分别在M55000，30000，28000检测到突变CTnI-EGFP、内源性肌钙蛋白I及其降解片断表达，正常对照组在帆30000，见肌钙蛋白I表达，未见降解片断。 结论：Adc CTnI Arg146Trp—EGFP突变基因在小鼠体内成功转染心肌组织并有明显表达及降解片断出现，小鼠心脏呈现明显室间隔肥厚；小鼠内源性肌钙蛋白-I磷酸化表达增强、降解与心肌肥厚的发生、发展及心肌功能的改变可能有关，但两者之间因果关系及确切机制还有待于进一步研究。     

心肌肌钙蛋白Ⅰ磷酸化及降解与肥厚型心肌病

目的观察心肌肌钙蛋白Ⅰ在肥厚型心肌病小鼠心肌组织中的磷酸化与降解作用.方法实验于2005-03/2006-01在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所及南京医科大学动物中心SPF级动物房进行.取4周龄BALB/c雌鼠12只,随机分为模型组6只,正常对照组6只,适应性饲养1周后模型组小鼠转染带有EGFP报告基因的CTnIArg146Trp突变基因.饲养至20周龄时二维超声心动图检测证实模型组小鼠室间隔肥厚,断颈处死两组小鼠后,称取小鼠心脏质量(湿),心尖部心肌组织光镜病理学检查,小鼠心肌组织进行Western Blotting检测重组蛋白、肌钙蛋白Ⅰ的磷酸化及降解表达,GAPDH作为内参半定量.结果12只小鼠进入结果分析.①模型组小鼠心脏明显增大,心脏质量(湿)/体质量比显著高于正常对照组(P＜0.01);模型组小鼠心肌细胞肥大、排列紊乱、间质血管增生、少量炎性细胞浸润;两组血清肌钙蛋白Ⅰ水平均正常(P＞0.05).②模型组小鼠心肌组织用抗EGFP单克隆抗体在Mr 55 000,24 000检测到突变CTnI-EGFP及其降解片断表达.③模型组在Mr55 000,30 000,28 000分别检测到磷酸化突变CTnI-EGFP、内源性肌钙蛋白Ⅰ及其降解片断表达,正常对照组在Mr30 000见磷酸化肌钙蛋白Ⅰ表达,模型组内源性磷酸化肌钙蛋白Ⅰ表达明显高于对照组(1.18±0.15,0.97±0.15,P＜0.05).④去磷酸化抗肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体在Mr55 000,28 000,检测到去磷酸化突变肌钙蛋白Ⅰ-EGFP、内源性肌钙蛋白Ⅰ降解片断表达,正常对照组未见去磷酸化肌钙蛋白Ⅰ表达;用针对不同位点的抗肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体3E3,2I-14,8I-7,MF4分别在Mr55 000,30 000,28 000检测到突变CTnI-EGFP、内源性肌钙蛋白Ⅰ及其降解片断表达,正常对照组在Mr 30 000,见肌钙蛋白Ⅰ表达,未见降解片断.结论Adc CTnI Arg146Trp-EGFP突变基因在小鼠体内成功转染心肌组织并有明显表达及降解片断出现,小鼠心脏呈现明显室间隔肥厚;小鼠内源性肌钙蛋白Ⅰ磷酸化表达增强、降解与心肌肥厚的发生、发展及心肌功能的改变可能有关,但两者之间因果关系及确切机制还有待于进一步研究.     

定量检测人超敏C-反应蛋白双抗体夹心ELISA方法的建立及初步临床应用

目的：建立定量检测人超敏C-反应蛋白（CRP）双抗体夹心EUSA方法。方法：采用Protein A亲和层析法纯化本室制备的抗CRP单克隆抗体（mAbs）,并行SDS—PAGE和Western blotting对纯化抗体特性进行鉴定;利用简易过碘酸钠法对抗CRPmAbs进行标记HRP后行抗体配对实验;通过方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体的最适工作浓度;以纯化的CRP抗原为标准品建立标准曲线;以重复性、灵敏性和回收率实验评价ELISA方法。初步对人血浆中的超敏CRP水平进行检测。结果：最佳配对组合为抗CRP mAb 1C10和HRP标记的抗CRP mAb2 C11,最适工作浓度分别为10μg／mL和l：2000,该方法的批内、批间变异系数分别为3．1％～9．7％和3．6％～13．6％,灵敏度达8．3ng／mL,回收率为90％～109％。用ELISA法测定左右冠无明显狭窄者68例,狭窄小于50％者59例和狭窄大于50％患者67例的血浆hs．CRP水平,冠脉狭窄小于50％组（3．7±1．2）mg／L与冠脉无狭窄组（1．8±0．7）mg／L比较明显升高（P〈0．05）;狭窄大于50％组（8．9±3．3）mg／L与狭窄小于50％组比较明显升高（P〈0．05）。结论：建立了一种可用于检测人超敏CRP的双抗体夹心ELISA方法。     

T型钙通道阻断剂对肥厚心肌L型钙通道电流及单细胞mRNA表达的影响

钙通道阻断剂咪拉地尔对T型钙通道有较高的选择性,在整体模型中对L型钙通道的作用尚不明确。本研究联合运用膜片钳技术及单细胞RT-PCR方法,研究二肾一夹肥厚     

C反应蛋白对小鼠主动脉内皮细胞胞内游离钙的影响

目的:研究C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)对小鼠主动脉内皮细胞胞内游离钙[Ca2+]i的作用?方法:原代培养小鼠主动脉内皮细胞,取生长状态良好的内皮细胞分为对照组(未加CRP)和不同浓度CRP处理组,25 min后观察各组内皮细胞[Ca2+]i?将内皮细胞用1 μmol/L阿托伐他汀预处理30 min后,加入100 mg/L CRP,观察阿托伐他汀对CRP作用的影响?结果:与对照组相比,CRP可显著升高内皮细胞胞内[Ca2+]i并呈剂量依赖关系;阿托伐他汀可明显降低CRP引起的[Ca2+]i升高?结论:CRP可导致和加重小鼠主动脉内皮细胞的炎症反应,阿托伐他汀可部分拮抗CRP的致炎作用?     

黄芪甲苷改善过氧化氢诱导的人主动脉内皮细胞氧化应激损伤的研究

目的：研究黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ）对过氧化氢（H2O2）诱导的人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells,HAECs）氧化应激损伤的改善作用。方法：体外培养的HAECs经饥饿处理后分为对照组、H2O2损伤组及AS-Ⅳ治疗组。H2O2损伤组细胞经H2O2（400 μmol/L)持续损伤36 h,AS-Ⅳ治疗组细胞经H2O2损伤12 h后加入含50 μg/mL AS-Ⅳ的培养基继续干预处理24 h。观察AS-Ⅳ对H2O2诱导的HAECs氧化应激损伤及线粒体功能损伤的修复作用。结果：H2O2损伤后HAECs 丙二醛（MDA）含量、NADPH氧化酶活性及线粒体活性氧（ROS）水平显著增加,超氧化物歧化酶（SOD）和锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活性及线粒体膜电位显著降低;H2O2损伤的HAECs 经AS-IV治疗后,HAECs的MDA含量、NADPH氧化酶活性及线粒体ROS含量明显降低,SOD和Mn-SOD活性及线粒体膜电位显著增高。结论：AS-Ⅳ对H2O2诱导的HAECs氧化应激损伤具有保护作用,提高线粒体的抗氧化功能是其可能的机制之一     

妊娠相关血浆蛋白-A的纯化与鉴定

目的:建立人妊娠血浆相关蛋白A(PAPP-A)的纯化与鉴定方法.方法:利用DEAE-Sephdex CL-6B离子交换和Heparin-sepharose CL-6B亲和层析进行分离纯化,变性SDS-PAGE测定其相对分子质量为200 kD,Western blotting鉴定其特异性.结果:获得相对分子质量为200 kD的蛋白条带,此条带可与妊娠血浆相关蛋白A单克隆抗体发生特异性反应.结论:成功地从孕妇血清中分离得到妊娠血浆相关蛋白A.