冬虫夏草蛋白提取物抗A549肺癌细胞及免疫活性分析

目的:观察冬虫夏草蛋白提取物(OSPE)对肺癌细胞A549的抑制作用,研究其对免疫功能的影响。方法:以OSPE低、中、高质量浓度(100,200,500 mg·L~(-1))处理A549细胞24 h;以200 mg·L~(-1)OSPE分别处理A549细胞12,24,48,72 h噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力;Hoechst 33258染色和流式细胞术检测细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime PCR)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA表达。利用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒,检测不同质量浓度OSPE对巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-1(IL~(-1)),白细胞介素-12(IL~(-1)2)的影响。结果:OSPE具有明显抑制A549细胞活力的作用,OSPE(100,200,500 mg·L~(-1))组抑制率分别为19.29%,58.70%,94.91%;200 mg·L~(-1)OSPE处理A549细胞(12~72 h),抑制率呈时间依赖性;Hoechst染色后,细胞呈现典型的凋亡形态变化,流式细胞检测凋亡率显示,200 mg·L~(-1)OSPE呈现时间依赖性地增加A549细胞凋亡率(P0.01);Real-time PCR结果显示OSPE明显上调Bax mRNA表达量,Bcl-2/Bax显著减小(P0.01)。ELISA检测结果显示,OSPE对正常巨噬细胞TNF-α,IL~(-1),IL~(-1)2具有显著促进分泌作用(P0.01)。结论:OSPE可通过上调Bax诱导凋亡,抑制A549细胞增殖;也可促进正常巨噬细胞分泌因子TNF-α,IL~(-1),IL~(-1)2的分泌,推测OSPE可通过诱导凋亡和激活免疫2种方式抑制肿瘤。     

基于生物信息学和质谱技术的阿胶特异性肽段筛选与鉴定

目的:建立基于生物信息技术和液质联用技术识别特征肽鉴别阿胶的新方法。方法:利用生物信息技术对驴皮、牛皮和猪皮I型胶原蛋白α1链氨基酸序列进行同源性比对发现3种皮类胶原蛋白氨基酸序列存在差异,通过生物学软件模拟胰酶酶解,分析比对驴皮、牛皮、猪皮来源I型胶原蛋白α1链酶解肽段,然后通过实验对样品前处理条件进行系统摸索,采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)进行验证。结果:筛选出12个驴皮的特异性肽段,鉴定出1个与预测结果一致的驴皮特异性肽段,其质荷比(m/z)为766.4,分子量为1 530.802 2,对应的多肽序列为GEAGPAGPAGPIGPVGAR,利用特征肽段对10组阿胶样品进行鉴定。结论:生物信息技术结合UPLC/Q-TOF-MS检测出的驴皮特征肽可有效、特异、准确地对阿胶药材进行专属性鉴定。     

凝胶染色扫描法快速定量冬虫夏草中蛋白质方法的初步研究

目的：建立一种冬虫夏草蛋白质含量快速测定方法,弥补Bradford法不足,为研究过程中快速准确定量蛋白质奠定基础。方法本研究用牛血清蛋白（bovine serum albumin,BSA）作为已知浓度的定量标准,用它来计算其它带的量。根据Quantity One来降低图像噪音和背景强度,并确定泳道,定义带并建立光密度与已知浓度的定量标准蛋白线性关系,通过每个带的光密度定量计算凝胶上每个带的质量。结果本实验所建立的凝胶染色扫描法能够较为快速、简便、准确地测定冬虫夏草蛋白含量。结论凝胶染色扫描法用于蛋白质定量,准确度、精密度、重复性均符合要求,为测定方法的进一步完善奠定了基础。     

阿胶肽图前处理胶原蛋白酶解条件研究

目的:建立标准化的阿胶蛋白酶解条件。方法:分别通过加热法、超声法及液氮碾磨法提取阿胶蛋白;通过二氯甲烷-环己烷萃取和超滤法纯化阿胶蛋白;采用序列分析级胰酶进行酶解,分别考察4个酶解参数(温度、时间、酶的剂量和pH值)对酶解结果的影响,通过Tricine-SDS-PAGE法检测酶解效果。结果:超声法溶解阿胶样品效果相对较好,酶解参数最佳条件为:酶解温度38℃,pH 8. 0,酶解时间12 h以上,底物与酶体积比在4:1~1:1范围内,计算酶活为0. 1~0. 4 mU (mg/μmol)。结论:建立了标准化的阿胶肽图前处理胶原蛋白胰酶酶解条件,为基于肽图谱法阿胶鉴别及质量控制方法的建立打下基础。     

冬虫夏草指标蛋白IP4的cDNA全长克隆及抗原决定簇预测研究

目的克隆获取冬虫夏草指标蛋白氰酸酶(IP4)的c DNA全长及对其抗原表位预测。方法结合课题组前期采用蛋白组学法筛选得到的冬虫夏草指标性蛋白IP4和冬虫夏草转录组数据,挖掘IP4 m RNA序列,并克隆IP4 c DNA全长,通过NCBI结构分析服务系统对IP4进行保守区和功能区分析,利用DNAMAN 6.0和DNAStar软件分别进行序列比对和抗原表位分析。结果从转录组数据中挖掘到IP4的2个可变剪接体,属于内含子保留的可变剪接。RT-PCR结果显示,IP4 c DNA全长465 bp,编码154 aa(氨基酸)。IP4蛋白的保守区和主要催化活性位点位于87～154 aa,该区域为氰酸酶家族保守核心区域和二聚体结合区域,DNAMAN 6.0分析结果表明1～39 aa和55～81 aa区具有较高种属特异性,DNAStar预测IP4蛋白的抗原表位区主要分布于25～90 aa。结论最终确定IP4的25～39 aa和55～81 aa为最佳抗原特异区,为后续规模化制备IP4蛋白特异抗原区及免疫法鉴定冬虫夏草奠定基础。     

双向电泳技术筛选鉴定冬虫夏草中指标性蛋白质研究

对名贵中药材冬虫夏草及其伪品建立稳定可靠的双向电泳鉴定方法。正品冬虫夏草中共同表达的蛋白质斑点为88个,伪品稳定差异表达的蛋白质斑点为21个,提示可作为下一步冬虫夏草鉴定的指标性组分。进一步质谱分析与NCBI数据库比对表明:6种蛋白仅来自于菌数据库,9种蛋白仅来自于昆虫数据库,12种蛋白仅来自于全库,3种蛋白昆虫和菌的数据库均能检索,1种蛋白仅来自于菌数据库和全库,提示下一步可进行冬虫夏草指标性蛋白质功能研究,为冬虫夏草有效成分研究奠定基础。