常压高氧对淀粉样蛋白前体/早老素1双重转基因小鼠脑内老年斑及β-淀粉样蛋白的影响

目的 探讨常压高氧(40%O_2,60%空气)处理淀粉样蛋白前体/早老素1(APP/PS1)双重转基因小鼠是否发挥神经保护作用.方法 对APP/PS1双重转基因阿尔茨海默病(AD)模型种鼠交配后产下的子代小鼠进行基因分型,待子代达10周龄时,取双重转基因小鼠40只,随机分成A、B、C、D 4组,每组10只,A、B 2组小鼠喂养于常压高氧中8 h/d,A组持续4周,B组持续8周;C、D组喂养于空气中4或8周,分别作为A、B组的对照.高氧处理后采用免疫组织化学、Thioflavin S染色检测小鼠脑组织形态学的变化,Western blot检测APP代谢过程中相关蛋白的表达变化,ELISA定量检测小鼠脑内β-淀粉样蛋白(Aβ)水平的变化.结果 免疫组织化学和Thioflavin S染色均显示,与对照组相比,高氧处理组小鼠皮质和海马内老年斑数量明显减少,B组比A组减少更显著.高氧处理组小鼠脑内C_(99)、C_(83)水平显著高于对照组,Aβ水平明显低于对照组,但各组小鼠脑内全长APP及β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)蛋白水平无明显改变.ELISA结果提示,B组小鼠海马和皮质内Aβ_(40)[(783.6±97.2)pg/ml]和Aβ_(42)[(175.3±17.1)ps/ml]含量明显低于对照组Aβ_(40)[(1251.6±42.3)pg/ml,t=9.36,P<0.01]和Aβ_(42)[(286.8±13.0)pg/ml,t=13.7,P<0.01]的含量.结论 常压高氧处理能显著减少AD模型小鼠脑内Aβ的产生、沉积及老年斑的形成;这种改变可能通过减少Aβ产生或加速Aβ清除实现.     

蛋白酶体抑制剂对神经细胞前咽缺陷蛋白-1表达的影响

目的 探讨神经细胞内前咽缺陷蛋白-1(Aph-1)的蛋白降解是经蛋白酶体途径还是经溶酶体途径介导.方法 在人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)建立稳定表达Aph-1细胞株的基础上,应用蛋白酶体和溶酶体酶抑制剂分别处理Aph-1细胞株,并结合Western blotting、放射性同位素脉冲示踪技术(Pulse-chase)、免疫荧光双标等技术,检测细胞内Aph-1的蛋白表达变化.结果 Western blotting结果显示,特异性蛋白酶体抑制剂能显著提高神经细胞内源性和外源性Aph-1的蛋白表达水平,且高度特异的蛋白酶体抑制剂乳胞素(Lactacystin)对Aph-1表达的增强效应呈剂量依赖性和时间依赖性;而非蛋白酶体蛋白酶抑制剂ALLM和溶酶体酶抑制剂对Aph-1的蛋白表达无影响;Pulsechase结果显示,蛋白酶体抑制剂可增强细胞内新合成Aph-1的表达水平,其增强作用是通过阻止35S-Aph-1的蛋白降解实现;免疫荧光双标结果显示,Aph-1与泛素在细胞内共存.结论 神经细胞内Aph-1的蛋白降解由蛋白酶体途径介导,与溶酶体途径无关;Aph-1在降解之前经泛素化修饰.

Abstract：

Objectives To investigate whether degradation of anterior pharynx decfective-1(Aph-1) goes through proteasomal pathway or lysosomal pathway.Methods Various methods such as cell culture,Western blotting,pulse-chase metabolic labeling technique,double immunofluoresecnt staining,combined with proteasomal and lysosomal inhibition were used to check Aph-1 expression level in stable Aph-1-transfected or non-transfected neuronal(SH-SY5Y)cell line.Results Using Western blotting,treating the neuronal cells with proteasome specific inhibitors significantly increased the expression of both endogenous and exogenous Aph-1.The effect of the proteasome inhibitors on Aph-1 expression was dose-and time-dependent Lysosomal pathway was not involved in Aph-1 degradation. Pulse-chase metabolic labeling experiment showed that the turnover of newly-synthesized radiolabeled Aph-1 protein was blocked by Lactacystin.Double immunofluorescent staining revealed colocalization of Aph-1 and ubiquitin in the same cells.Conclusion Degradation of Aph-1 protein is mediated by proteasomal pathway in neuronal cells,and is not related to lysosomal pathway.Aph-1 protein is ubiquitinated before degradation.     

大鼠椎管减压与细胞凋亡的相关性研究

目的:观察在大鼠脊髓压迫性损伤后椎管减压与神经细胞凋亡的关系.方法:健康成年SD大鼠36只,随机分为两组:(1)椎管减压组30只,每组10只,采用自制压迫装置于L_1水平制做椎管减压模型;(2)假手术组6只,只做全椎板切除不做脊髓压迫.用HE、Nissl、TUNEL、免疫组化和Western blot等方法,分别于脊髓压迫6、12 h和24 h后去除压迫装置,观察减压段脊髓组织病理变化、细胞凋亡与caspase-3的表达变化情况.结果:TUNEL(+)细胞数于6 h减压时开始增高(9.62±3.54),24 h减压时达峰值(26.09±4.11),与假手术组(3.38±1.04)相比具有显著性差异(P<0.05);各减压组间比较有显著性差异(P<0.05).caspase-3免疫反应与TUNEL(+)细胞数量表达变化相符.结论:大鼠脊髓损伤后,神经细胞凋亡的改变与脊髓受压时间长度相关;早期进行椎管减压可减少继发性神经细胞凋亡,加快神经功能恢复.     

蛋白酶体抑制剂对神经细胞nicastrin表达的影响

目的:探讨蛋白酶体抑制剂能否引起神经细胞内nicastrin(NCT)蛋白表达及分布的变化,以明确NCT的蛋白降解是否与蛋白酶体有关。方法:在用人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)建立稳定表达NCT细胞株的基础上,应用蛋白酶体抑制剂处理NCT细胞株,并结合Western blotting、放射性同位素脉冲示踪技术、免疫荧光双标技术,检测蛋白酶体抑制剂处理后神经细胞内NCT的蛋白表达变化。结果:Western blotting结果显示,特异性蛋白酶体抑制剂处理后,神经细胞内源性和外源性转染的NCT的表达显著增强,高度特异的蛋白酶体抑制剂lacta-cystin对NCT蛋白的增强效应呈剂量依赖性和时间依赖性;放射性同位素脉冲示踪结果显示,蛋白酶体抑制剂可显著增强细胞内新合成的NCT蛋白的表达水平,其增强作用是通过阻止[35S]-NCT的蛋白降解来实现的;免疫荧光双标结果提示,NCT与泛素在细胞内共存。结论:神经细胞内NCT的降解由蛋白酶体途径介导;NCT在降解之前经泛素化修饰。     

丙戊酸钠对APP/PS1双重转基因AD模型小鼠脑内老年斑和神经元的影响

目的 探讨丙戊酸钠 (valproic acid sodium salt,VPA)处理对淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)/早老素1(presenilin1,PS1)双重转基因阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠是否发挥神经保护作用.方法 对APP/PS1双重转基因AD模型种鼠交配后产下的子代进行基因分型,运用VPA 30 mg/(kg·d)和等量生理盐水腹腔注射APP/PS1双重转基因小鼠4周.药物处理后采用免疫组化、甲硫素S染色检测VPA对老年斑(senile plapues,SP)的影响,用Nissl染色、Tunel染色观察脑内神经元的变化,并采用ELISA定量检测小鼠脑内β-淀粉样蛋白(amyloid β peptide,Aβ)水平.结果 免疫组化及甲硫素S染色结果显示:VPA治疗组较生理盐水组的小鼠大脑皮质及海马区域的老年斑数量明显减少(t ＝ 7.78,P ＜ 0.01).Nissl染色发现VPA治疗组小鼠皮质及海马内的神经元数目较生理盐水组增加;Tunel染色显示VPA治疗组小鼠脑内凋亡神经元明显减少(t ＝ 5.95,P ＜ 0.01);ELISA结果提示VPA治疗组小鼠脑内Aβ40(t ＝ 4.23,P ＜ 0.01)和Aβ42(t ＝ 7.51,P ＜ 0.01)水平显著低于对照组.结论 VPA处理能显著减少AD模型小鼠减少脑内Aβ的沉积和老年斑的形成,通过减少神经元的凋亡来增加神经元的数量.     

脑局灶性缺血再灌大鼠AQP4与Kir4.1表达与脑水肿正相关

目的 研究大鼠脑局灶性缺血再灌注（CIR)后水通道蛋白4(AQP4)与内向整流性钾通道（Kir4．1）在脑组织中的表达变化,探讨两者在脑水肿形成中的作用。方法 136只SD大鼠随机分为CIR组与假手术对照组, 线栓法制作CIR模型,缺血2h后再灌注。CIR后6、12、24、48h和72h以及7d取出脑组织,干湿重法、伊文氏蓝(EB)测定法、免疫荧光双标和RT-PCR检测脑水含量(BWC)、血脑屏障(BBB)通透性、AQP4与Kir4.1mRNA的表达,计算两者表达量比值。结果 CIR后6h开始,脑水含量呈时间依赖性,48~72h达到高峰。EB 含量在CIR后6h开始增高,12/48h出现双峰值。CIR后AQP4与Kir4.1在室管膜等水代谢密切相关界面上差异表达,各时间点AQP4与Kir4.1mRNA均较假手术组增高,CIR 12h内两者比值较假手术组无明显差异,12h后比值逐渐增大。结论 再灌注早期脑水肿主要由血脑屏障开放引起,而AQP4与Kir4.1再分布在后期脑水肿的形成中发挥重要作用。     

脑红蛋白在内毒素休克大鼠模型中的表达变化

目的：探讨内毒素休克模型大鼠海马、脑脊液、血浆脑红蛋白（Ngb）的表达变化及其意义.方法：选用SD大鼠70只,随机分为7组（n=10）：对照组,经尾静脉注入0.5mL生理盐水;内毒素干预3,6,12,24,48,72h不同时间点组,经大鼠尾静脉注射0.5mL革兰氏阴性菌胞壁脂多糖（LPS）,0.016g/kg,制作内毒素休克模型.对照组注射生理盐水后6h、内毒素干预不同时间点各组分别注射LPS后,于3,6,12,24,48,72h收集血浆、脑脊液,并处死大鼠留取海马.应用酶联免疫吸附法、免疫印迹法、免疫组织化学法检测标本中Ngb含量;应用干燥法检测海马组织含水量.结果：注射内毒素后,大鼠海马、脑脊液、血浆中Ngb含量显著高于对照组（P〈0.01）,48h达峰值,分别为34.89,22.01,14.01mg/L.免疫印迹法结果显示,内毒素干预不同时间点各组表达Mr均为17×103Ngb蛋白,Ngb蛋白表达量也显著高于对照组.注射内毒素后大鼠脑海马组织含水量明显高于对照组（P〈0.01）,48h含水量达峰值为0.8313.结论：Ngb表达量的上调与大鼠脑损害严重程度成正相关,其过度表达是全身性的,与内毒素处理的时程密切相关,Ngb表达上调可能是在内毒素休克状态下机体的内源性神经保护机制之一.     

大鼠脊髓缺血再灌注损伤中Ire1α、caspase-12的表达与细胞凋亡

目的 观察在大鼠脊髓缺血再灌注损伤过程中Ire1α与caspase-12的表达变化规律及其与神经细胞凋亡的关系. 方法 健康成年SD大鼠55只,用随机数字表法分为2组:(1)脊髓压迫缺血再灌注组(手术组,50只大鼠),每个时相点10只,采用自制压迫装置制备脊髓压迫缺血再灌注模型;(2)假手术对照组(手术组,5只大鼠),只做全椎板切除不做脊髓压迫.用TUNEL、免疫组化、Western blot和免疫荧光标记等方法 ,分别于缺血再灌注后1,4,8,16和24 h检测压迫段脊髓组织中细胞凋亡以及lre1α,caspase-12的表达变化情况. 结果 细胞凋亡数量随着缺血再灌注时间的延长而增加.手术组Ire1α、caspase-12的阳性细胞数及蛋白量于再灌注1 h开始增加,16 h达峰值,24 h开始减少,但仍然高于假手术对照组(P＜0.05). 结论 Ire1α与caspase-12共同参与了内质网应激介导的神经细胞凋亡.     

常压高氧处理对APP/PS1转基因小鼠空间学习记忆能力的影响

目的 探讨常压高氧(NH)处理是否改善APP/PS1双重转基因AD模型小鼠的空间学习和记忆能力.方法 对APP/PS1双重转基因AD模型种鼠交配后产下的子代小鼠进行基因分型,待子代达10周时,取双重转基因小鼠20只,随机分成A、B2组(每组10只).A组小鼠给予常压高氧(40%O_2, 60%空气)处理,8h/d,持续8周;B组常规喂养,作为对照.高氧处理后进行Morris水迷宫实验,分别检测各组小鼠在可视平台、隐蔽平台及空间探索实验中找到平台的时间及搜索的平均路程;行为学实验结束后,采用ELISA定量检测小鼠脑内Aβ水平.结果 行为学实验结果:(1)可视平台下,2组小鼠找到平台的时间及搜索的平均路程差异尤显著性(P>0.05);(2)隐蔽平台下,高氧处理组小鼠找到平台的时间及搜索的平均路程较对照组明显缩短(P<0.01);(3)空间探索实验中,高氧处理组小鼠经过平台的次数[(6.31±2.55)次]显著高丁对照组[(3.13±1.59)7欠](P<0.01).ELISA结果显示,高氧处理组小鼠大脑皮质及海马内Aβ40[(783.64±97.21)pg/ml和Aβ42(175.30±17.09)pg/ml]水平显著低于对照组[Aβ40(1251.59±42.29)pg/ml、Aβ42(286.83±12.96)pg/ml](P<0.01).结论 常压高氧处理能显著改善AD模型小鼠空间学习记忆障碍;常压高氧可能通过减少Aβ生成或/和促进血管内皮细胞清除Aβ而发挥作用.