血常规在感染判定的价值

感染性疾病是儿科最常见的疾病之一,是由病原体侵入机体引起的局部组织损伤或全身炎性反应。儿童免疫力低下,病情进展快,需早期诊断及时治疗。各种感染性疾病的临床症状无显著特异性,尤其在早期阶段,而作为诊断金标准的病原学检测,因对检验环境要求高、耗时长、阳性率低及易污染等缺点,不利于早期诊断。血常规是临床上最基本及廉价易行的检验项目,具有操作简单、用时短等优点,主要检测白细胞、红细胞、血小板等血液有形成分的质和量及形态变化,特别是白细胞检测对感染性疾病的早期诊断、鉴别诊断,评估严重程度及治疗效果均具有重要价值,是目前儿科临床诊断感染性疾病的首选辅助检查方法。     

单细胞PCR用于HLA配型的研究

目的研究用筑巢式多重PCR技术对单细胞进行HLA配型，分析影响单细胞PCR扩增的因素。方法首先分别采用不同的细胞裂解方法制备单细胞DNA模板，然后采用多重PCR分别扩增HLA—A，B基因的第2、3外显子和第2内含子区域，HLA—DRB1基因的第2外显子区域，最后根据大量DNA的常规HLA分型结果对单细胞第1轮扩增产物进行第2轮筑巢式序列特异性引物PCR（PCR-SSP）分型。结果酶解法制备单细胞DNA模板效率最高，第1轮扩增成功率为93．3％，而碱裂法和冻融法分别为83．3％和73．3％；采用酶解法制备单细胞DNA模板进行第2轮PCR—SSP分型验证，20份标本扩增成功率为95％，有3份标本只扩增出一条染色体，等位基因脱扣发生率为15％，全部操作可在6h内完成。结论筑巢式多重PCR技术对单细胞HLA分型具有较高的扩增效率，操作时间短，可望应用于妊娠前诊断。     

骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的动态观察

目的:探讨体外诱导骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的可能性,并观察其动态变化。方法:实验于2005-09/2007-03在山东大学齐鲁医院完成。①标本来源:骨髓标本15例来自山东大学齐鲁医院成人骨髓检查结果正常者,均签署捐献同意书。②实验方法:无菌条件下取骨髓2.0～5.0mL,采用percoll分离液和贴壁法获得纯化的成人骨髓间充质干细胞。③实验评估:流式细胞仪行细胞表面抗原检测,在适当的条件下诱导其分化为成骨细胞和脂肪细胞。采用两步法向胰岛素分泌细胞诱导,观察其在碱性成纤维细胞生长因子、活化素A、胰岛素样生长因子、尼克酰胺等因子刺激下向胰岛素分泌细胞分化的动态变化。双硫踪染色鉴定胰岛样细胞团,酶联免疫吸附试验检测细胞分泌胰岛素的情况,RT-PCR检测胰岛细胞特异基因的表达。结果:①骨髓间充质干细胞的生长特性及免疫表型:分离培养获得的贴壁细胞,呈形态均一的梭形,流式细胞仪检测CD34、CD45表达阴性,CD29、CD44表达阳性。②向成骨细胞和脂肪细胞的诱导分化:此类细胞经茜素红染色、油红O染色均呈阳性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。③向胰岛素分泌细胞的诱导分化:第1步诱导后出现细胞簇,双硫腙染色不着色,胰岛素分泌量少,仅检测到PDX-1基因的表达,证实其为胰岛前体细胞。第2步诱导后细胞簇数目逐渐上升,至诱导14d大部分细胞簇经双硫腙染色都呈红色。④诱导后培养上清中胰岛素含量:诱导第3,7,14,21天的胰岛素分泌量分别为(15.3±4.9),(34.1±5.6),(40.4±5.3),(39.8±5.1)mU/L。⑤胰岛细胞特异基因的表达:诱导7d仅检测到PDX-1基因的表达,insulin1、insulin2和Glut2基因均不表达。诱导14,21d检测到insulin2、PDX-1基因表达,insulin1基因弱表达,Glut2基因不表达。结论:体外分离、纯化得到的骨髓间充质干细胞诱导7d可分化出胰岛前体细胞,不具功能性;诱导14d后可成功地分化出成熟的具有功能性的胰岛素分泌细胞。     

混合脐血移植重建小鼠免疫造血功能的研究

目的:探索多份脐血混合移植重建免疫造血系统的可能性,扩大脐血移植的应用范围。方法:将1×10~6个C57BL/6和1×10~6个615小鼠脐血单个核细胞(MNC)同时输注给经致死量照射的BALB/c小鼠,10～15天后检查受鼠的脾结节(CFU-S),作受鼠的骨髓粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)培养,以检测造血重建;1个月后用流式细胞仪(FCM)检测受鼠体内供者细胞的嵌合状态;用单向混合淋巴细胞反应(MLR)检测免疫重建和免疫耐受;用受鼠小肠和皮肤病理切片检测移植物抗宿主病(GVHD)。结果:混合脐血移植小鼠的生存率为65％,未移植小鼠全部死亡;移植后10～15天在小鼠的脾脏可以检测到CFU-S,小鼠骨髓培养有CFU-GM生长;移植后30天发现在同一个小鼠的体内有2个供者的不全嵌合体同时存在;受鼠对两个供鼠的淋巴细胞均产生了免疫耐受;受鼠小肠和皮肤病理切片检查表明有轻-中度GVHD。结论:混合脐血移植可以重建同种异基因小鼠的免疫和造血功能而不引起重度GVHD。本研究为扩大脐血移植的应用范围打下了一定的理论和实践基础。     

体外扩增脐血巨核细胞生物学特性的研究

目的:研究脐血巨核细胞的体外扩增及扩增后脐血巨核细胞的生物学特性和功能,为脐血巨核细胞的扩增和临床应用提供依据。方法:收集16份足月妊娠健康新生儿的脐带血,免疫磁珠法分离出其中的CD34 细胞。采用细胞因子组合(1)(TPO加SCF加IL-3加IL-6)、细胞因子组合(2)(TPO加SCF)2种细胞因子组合．将富集的脐血CD34 接种于无血清无基质细胞的悬浮培养体系中,分别在3、7、10、14 d收集扩增产物。运用流式细胞术检测巨核细胞的表型和黏附分子的表达;血浆块法检测巨核细胞集落(CFU-MK)的形成;对巨核细胞进行DNA含量检测以评价巨核细胞的成熟程度。结果:不同细胞因子组合和培养时间扩增后,巨核细胞的数量和生物学特性不同。随着培养时间的延长,巨核细胞(CD41 )的数量逐渐增加,但培养至14 d时增势减缓。因子组合(1)各时间段的扩增能力(分别扩增5．2、40．7、121．2、149．7倍)均比因子组合(2)(分别扩增3．8、27．4、85．9、106．5倍)强(P<0．05),但因子组合(2)的扩增能力仍能满足临床的需要。巨核祖细胞(CD34 ／CD41 )的数量在7 d时最多,这也被CFU-MK所证实。DNA含量检测发现．随着培养天数的增加,多倍体细胞所占的百分比增加。扩增后巨核细胞黏附分子CD49d和CD11a的表达维持在高水平,而CD54降低(P<0．05)。结论:通过对扩增后巨核细胞的生物学特性研究,有助于寻找有效、简便、易于植入受者体内的扩增方法。     

儿童急性淋巴细胞白血病患者T淋巴细胞免疫功能的研究

目的 :研究儿童急性淋巴细胞白血病 (ALL)患者初治时和完全缓解 (CR)后外周血T淋巴细胞亚群及其分泌细胞因子的能力。方法 :采集B淋巴细胞系ALL儿童初治时、CR后的外周血 ,分离出其中的单个核细胞 (MNC)。用单克隆抗体在流式细胞仪上测定CD3、CD4、CD8以及IL 2受体CD2 5的含量 ;通过T淋巴细胞内细胞因子IFN γ和TNF α的测定 ,在单个细胞水平上分析T淋巴细胞功能的变化。结果 :①初治时 ,患者的CD4 /CD8为 (1.10± 0 .79) ,较健康儿童 (2 .74± 1.2 1)明显降低 (P <0 .0 1) ,CD4、CD8产生细胞因子IFN γ和TNF α的能力均低于正常对照 (P <0 .0 5 )。②CR后 ,CD4 /CD8为 2 .5 4± 1.39,比初治时明显提高 (P <0 .0 5 ) ,CD4、CD8产生细胞因子的能力增强 ,但与正常对照组相比 ,各项数值仍低。③初治患者的CD4 + CD2 5 + T淋巴细胞为 (0 .76± 0 .5 6 ) ,明显低于CR组 (2 0 .4± 5 .1) (P <0 .0 1)和对照组 (16 .3± 6 .3) (P <0 .0 1)。这表明 ,免疫损害在白血病的发病过程中起重要作用的细胞因子的产生和CD2 5都趋于正常。结论 :T淋巴细胞的免疫功能与儿童白血病的预后关系密切 ,促进患者免疫功能的恢复对本病的治疗非常重要     

不同冻存液及降温方式对心脏瓣膜组织学及免疫原性的影响

目的 探讨液氮冻存心脏瓣膜的合适冻存保护剂及降温方式。 方法 将健康捐赠者的心脏瓣膜剪切为7份:新鲜对照组1份,冻存液A、B、C 3个组每组2份,分别为-80 ℃直接降温组(G1组)和程控降温仪缓慢降温组(G2组)。采用苏木精-伊红染色、弹力纤维染色、Masson染色法观察显微结构变化,透射电子显微镜(TEM)观察超微结构变化,采用Western blotting法及免疫组织化学法检测瓣膜表面人类白细胞抗原复合体(HLA)的相对表达量,比较各组瓣膜组织免疫原性。 结果 低温冻存会造成瓣膜组织结构损伤,使用含DMSO和硫酸软骨素的冻存液B组结构最完整,组织损伤最小,HLA-I蛋白的表达明显下调;G2组与 G1组相比,胶原纤维着色偏浅,纤维排列更加紊乱,但HLA-I蛋白的表达相对较低。 结论 同时含有DMSO和硫酸软骨素对冻存组织保护效果最好,免疫原性最低。-80 ℃直接降温更有利于胶原纤维的保存,但免疫原性高于程控降温法。     

儿童恶性淋巴瘤48例误诊分析

淋巴瘤是起源于淋巴网状组织的恶性肿瘤,是儿童期常见的恶性肿瘤。但由于临床表现复杂,缺乏特异性的临床表现和体征,故早期诊断困难。我院儿科自1991年1月～1997年12月共收治56例淋巴瘤患儿,其中48例为首诊误诊患儿,占85.7％,现报告如下。 1 临床资料 1.1 一般资料:本组共48例,男31例,女17例。年龄最小者1.5岁,最大者14岁,中位年龄8岁。从起病至确诊时间>2个月者35例,>6个月     

混合脐血移植的实验研究

为探讨混合脐血移植重建免疫造血系统的可行性,扩大脐血移植（CBT）的应用范围,将孕20日的C57BL／6（H-2b）小鼠和615（H-2k）小鼠经剖腹产取出胎盘和胎鼠,剪碎后分离出脐血单个核细胞（MNC）,将二者各1×10     

三维和二维培养的脐带间充质干细胞DNA甲基化水平比较

目的 探讨三维培养对脐带间充质干细胞(UC-MSCs)全基因组DNA甲基化状态的影响。 方法 通过贴壁培养法获得UC-MSCs,采用流式细胞术鉴定其细胞表型。采用聚氟乙烯巢状片进行三维培养,吖啶橙荧光观察UC-MSCs在支架上生长情况。采用甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP-Seq)技术检测细胞全基因组DNA甲基化情况。 结果 成功分离培养UC-MSCs并证明其表型符合国际标准,细胞黏附在聚氟乙烯巢状片三维培养体系中且生长良好。MeDIP-Seq结果显示,三维培养后UC-MSCs全基因组DNA甲基化水平较二维培养整体上调。基因本体(GO)分析显示,与二维培养的细胞相比,三维培养的UC-MSCs中上调的差异甲基化基因多参与蛋白质的代谢、膜相关细胞器的组成、酶活性调节等;而下调的差异甲基化基因主要参与囊泡运输和cGMP代谢过程。通路分析显示,三维培养的UC-MSCs中上调的差异甲基化基因多参与RNA转运、神经配体受体活性、Notch信号通路等;下调的差异甲基化基因多参与磷酸肌醇代谢通路和囊泡分泌相关的通路。 结论 三维培养改变了UC-MSCs的DNA甲基化谱,所涉及的甲基化上调基因多参与细胞的迁移和增殖功能。三维培养降低了UC-MSCs的免疫调控和分泌囊泡相关基因的甲基化水平。