脐带源性和脐血源性间充质干细胞分离培养方法的比较

目的建立分离培养人脐带间充质干细胞（UCMSCs）和脐带血间充质干细胞（UCBMSCs）的方法,并比较其效果。方法无菌条件下采集健康足月新生儿脐带及脐血各30份,分别通过原代贴壁培养法、酶消化法培养UCMSCs,及淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步分离法获得脐血中单个核细胞培养UCBMSCs。应用含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基,比较UCMSCs和UCBMSCs分离培养的效果与生长形态。流式细胞术检测其表面标志及诱导分化鉴定其分化能力。结果UCMSCs原代贴壁培养法8d左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出且成簇生长,酶消化法培养UCMSCs5d左右均匀生长;UCBMSCs分离培养用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法得到的细胞数量较淋巴细胞分离法明显增多。两种来源MSCs培养方法相比较,UCMSCs原代培养的时间短,培养成功率明显增高。流式细胞仪检测两种来源的MSCs具有MSCs表面标志特征。定向诱导分化结果表明MSCs具有被诱导为成骨细胞、脂肪细胞的分化能力。结论人脐带来源间充质干细胞原代培养周期短,培养效率更高;脐血间充质干细胞的分离方法中羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法效率更高。     

人脐带间充质干细胞原代培养方法的改良

目的: 探讨体外组织块培养原代人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的改良方法,并观察其形态,免疫表型,成脂成骨分化等生物学特性。方法: 从健康足月儿获得脐带,将血管剥离后,余下的结缔组织剪成小块,分别用传统植块法和改良植块法分离培养原代hUC MSCs。MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞免疫表型,成脂成骨诱导分化检测其分化潜能,化学染色鉴定诱导分化结果。结果： 改良植块法脐带组织贴壁培养3～4 d即可从组织块边缘长出长梭形成纤维样原代细胞,5～6 d后细胞可长满80%,比传统植块法原代细胞培养周期缩短了一半以上时间,细胞传代后流水状或漩涡状生长,MTT法显示细胞增殖能力强,流式细胞仪检测提示CD90, CD105,CD73,CD166,CD29,CD44均阳性表达,阳性率均在95%以上,CD45和HLA-DR均阴性表达,阳性率低于2%;诱导分化实验及化学染色结果证实, 该细胞具有成脂和成骨多向分化潜能。结论：应用与酶消化法相结合的改良植块法可以获得hUC-MSCs,比传统植块法缩短了原代培养周期,提高了细胞培养效率,所获得细胞贴壁生长,增殖能力强,表达间充质干细胞相关免疫表型,具有多向分化潜能,可在科研和临床应用中作为种子细胞来源。     

脐带源间充质干细胞的分离和生物学性状

目的建立从脐带分离间充质干细胞的方法,并研究其生物学性状。方法脐带经酶消化后于DMEMLG/F12培养基中培养,倒置显微镜及电镜观察细胞形态学,细胞计数绘制细胞生长曲线,计数成纤维细胞集落形成单位(CFUF),流式细胞仪测定细胞周期及细胞免疫表型,免疫组织化学染色及RTPCR检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力,RTPCR检测其细胞因子的分泌,与脐血来源CD34+细胞共同培养检测其支持造血的能力。结果经酶消化后,每cm脐带可得到中位数为1.01×106的有核细胞,CFUF产率为1/1609有核细胞,经贴壁传代可分离出成纤维样细胞,细胞倍增时间为(28.02±10.53)h。流式细胞仪分析细胞周期显示,>80%的细胞处于G0/G1期,S+G2+M期的细胞仅占(13.04±4.31)%。免疫表型分析显示,CD13、CD29、CD44、CD105(SH2)、CD73(SH3)、CD166和MHCI阳性,CD45、CD34、CD38、CD31和MHCⅡ阴性。体外诱导实验证实,该细胞具有成脂肪和成骨分化的能力。RTPCR显示,该细胞表达干细胞因子、血小板生成素,酪氨酸激酶受体配基、白细胞介素6、巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、基质细胞衍生因子和血管内皮细胞生长因子,不表达白细胞介素3。与脐血来源CD34+细胞共同培养2周可见鹅卵石形成区,共培养8周证实其支持长期造血能力。结论建立从脐带中分离间充质干细胞的方法,脐带是间充质干细胞的新的来源。     

人脐带间充质干细胞分离培养方法的优化

目的：优化人脐带间充质干细胞 （ umbilical cord mesenchymal stem cells, UC - MSCs）分离培养的方法。方法：无菌条件下剔除剖腹产胎儿脐带动静脉,用牙剪子剪为约lmm。但彼此相连的组织块,得到贴壁细胞,采用半量换液进行原代及传代培养。用流式细胞仪检测其免疫表型。结果：成功从人脐带中分离纯化得到UC—MSCs,呈条形和成纤维细胞样的两种形态。UC—MSCs高度表达CD105、CD73．CD44、CDg0,极少数表达CIM5、CD34-CD14和HLA—DR。结论：建立出一种快捷经济的UC—MSCs体外分离培养方法。     

人脐带间充质干细胞体外培养的生物学特性研究

目的建立人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外培养的方法,探讨该方法培养的脐带间充质干细胞特性及分化潜能。方法用新取的脐带制成细胞悬液,放入含10%胎牛血清的DMEM/F-12混合培养基培养,动态观察原代培养细胞的生长过程。取生长状态良好的第三代细胞(P3),MTT检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测表面标志物CD29、CD44、CD31、CD45、CD34,鉴定hUC-MSCs;诱导hUC-MSCs分化成为脂肪细胞,鉴定所分离的hUC-MSCs具有多向分化能力。结果来源于人脐带培养的MSCs呈现梭形生长,经流式细胞仪检测示CD29(98.3%)、CD44(99.2%)阳性,CD34(0.3%)、CD31(0.8%)、CD45(0.4%)阴性,经过诱导分化,证实hUC-MSCs有成脂分化潜能。结论采自脐带标本分离培养可获得稳定、均质性良好的hMSCs,并具有多向分化能力。     

脐带间充质干细胞染色体核型制备及安全评估

目的探讨脐带间充质干细胞染色体核型制备方法,评估脐带间充质干细胞安全性。方法对培养至第2、5、8、10、11代的共15例脐带间充质干细胞进行染色体制备,检查其有无异常。结果成功制备染色体标本,成功率为100%,正常核型率为100%。结论该脐带间充质干细胞染色体制备方法实验结果稳定、成功率高。脐带间充质干细胞在培养至11代时未见异常染色体核型。     

人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。方法收集健康足月新生儿脐带组织,采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面抗原,将细胞冻存3个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高;细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105,不表达造血干细胞表型CD34、CD45等;冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞,为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。     

人脐带源间充质干细胞的培养及生物学性状

目的 建立从脐带分离培养间充质干细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 脐带经剪碎置于?MEM培养基中培养至细胞爬出,细胞生长达80%培养皿底后传代,整个过程用倒置显微镜观察细胞形态,绘制生长曲线,用免疫荧光方法测定细胞免疫表型并研究其冻存及复苏.结果 脐带组织经直接贴壁培养法可培养出成纤维样细胞,免疫表型分析CD44和CD20阳性,冻存复苏后细胞存活率在90%以上,增殖能力强,和未冻存过的传代细胞具有同样的生长特性.结论 脐带组织培养可获得大量间充质干细胞,为间充质干细胞应用于科学研究和临床治疗提供了新的细胞来源.     

运用组织工程学原理构建间充质干细胞的三维培养体系

目的　探讨普通重力和模拟微重力条件下构建人间充质干细胞的三维培养体系。方法　将人间充质干细胞和人发角蛋白共同置于普通重力和模拟微重力条件下进行培养。结果　当转速为 37.2r min时 ,人发角蛋白在旋转式细胞培养系统中呈悬浮状态 ,沿一条与氧交换膜的轴心垂直的环形轨道随液体流转动 ,1× 10 3个 ml的人间充质干细胞和人发角蛋白共培养 7d ,在模拟微重力条件下有较多的间充质干细胞贴附生长于人发角蛋白表面 ,密集、平行排列 ,细胞在人发表面几乎形成密集的一层 ,在普通重力条件下人发角蛋白表面生长的间充质干细胞较稀疏 ,大多呈多角形。结论　普通重力和模拟微重力条件均适合于间充质干细胞的三维培养 ,而后者更有利于人间充质干细胞的三维培养体系的构建     

人脐带间充质干细胞分离培养建立及其生物学特性观察

目的:建立从人的脐带组织中分离和培养脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的方法,并探讨UC-MSCs的生物学特性。方法:分别采用原代贴壁培养法和酶消化法(胶原酶Ⅱ和胰酶)分离培养UC-MSCs,瑞氏染色观察细胞形态,流式细胞术检测第3代以后的UC-MSCs表面特异标志物表达,MTT法检测P7细胞增殖情况。UC-MSCs同外周血单个核细胞共培养后,用MTT法测定细胞增殖率,Hoechst与PI双染色,观察UC-MSCs对健康人淋巴细胞增殖的影响。结果:原代贴壁培养法1周左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出,成簇生长;酶消化法3~5天可见成纤维样细胞均匀生长。传代培养后,UC-MSCs均呈长梭形、旋涡状生长;细胞核大,核仁清晰;免疫表型:CD29阳性率为(95.71±2.23)%,CD31和CD34阳性率分别为(2.47±0.54)%和(3.24±0.34)%;第7代UC-MSCs仍具有较强的分裂增殖能力。UC-MSCs对淋巴细胞的增殖反应具有抑制作用,呈细胞数量剂量依赖性,而淋巴细胞对UC-MSCs的生长未见影响。结论:从人脐带中成功分离培养的细胞具有UC-MSCs生物学特性。     

食蟹猴脐带间充质干细胞的分离与鉴定

目的建立食蟹猴脐带间充质干细胞的分离培养方法。方法新鲜食蟹猴脐带剪碎为糊状,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养,观察细胞形态特征,流式细胞技术分析细胞抗原标志的表达,并检测其体外多向分化潜能。结果运用组织贴块法可以从新鲜脐带中分离到贴壁生长、阳性表达CD29、CD44、CD90的成纤维细胞样细胞。这些细胞在体外诱导培养后可分别检测到脂滴、骨和软骨细胞。结论运用组织贴块培养法可用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液从食蟹猴脐带中分离到间充质干细胞。     

脐血间充质干细胞对脐血单个核细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血源间充质干细胞（mesenchymal stem cells derived fromumbilical cord blood,UCB—MSCs）联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞（umbilical cord blood mononuclear cells,UCB—MNCs）体外扩增的支持作用。方法从脐血中培养出UCB—MSCs,检测其表面抗原,并以此作为滋养层细胞,将UCB—MNCs接种于无血清培养体系中培养10d,检测有核细胞总数（MNCs）、CD34^＋．CD133^＋细胞数、集落形成单位数（CFU）和（G—M＋S）期细胞含量的变化。结果从脐血分离、培养出UCB—MSCs,稳定表达CD29、CD105和CD44,不表达CD34和CD133。外源性细胞因子及UCB—MSCs均支持UCB—MNCs的扩增,但以细胞因子联合UCB—MSCs组效果最好（P〈0．05）。结论从脐血中能成功分离培养出间充质干细胞,并完成细胞表型的初步鉴定。外源性细胞因子联合UCB—MSCs可有效扩增UCB—MNCs。     

人脐血间充质干细胞向肝细胞样细胞的分化

目的 从脐血中获得间充质干细胞（MSC）,探索体外诱导MSC向肝细胞分化的实验条件。方法 无菌采血,分离脐血单个核细胞。以贴壁培养法获得MSC,采用流式细胞术检测细胞表面标志。分别用联合诱导法(联合诱导组)以及阶段诱导法(阶段诱导组)诱导MSC向肝细胞分化。采用RT-PCR检测ALB、AFP及CK19mRNA的表达情况。结果 MSC呈长梭形,第三代（P4）后增殖较快。流式细胞术检测表明：CD29及CD44阳性,而CD34及CD45阴性。诱导6周后,联合诱导组无变化,而阶段诱导组细胞由长梭型变为不规则型,并检测到AFP mRNA的阳性表达,而未见ALB、CK19 mRNA的表达。继续诱导2周,检测到AFP、ALB、CK19 mRNA的表达。结论 脐血中的MSC对高密度、高血清的依赖性高。在体外,阶段诱导方法可将MSC诱导成肝细胞。     

脐带间充质干细胞无血清培养的实验研究

目的建立一种简单的体外无血清培养扩增人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）的方法。方法利用酶消化法分离hUCMSCs,在无血清干细胞培养体系下培养扩增,进行形态学观察,CCK-8法分析细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞表面抗原表达及细胞周期,进行成骨、成脂诱导分化。结果hUCMSCs呈典型的成纤维细胞形态,具有较强的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达,而CD34、CD45呈阴性表达。3周可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用酶消化法和无血清的培养体系能够快速分离培养出大量hUCMSCs,该方法扩增得到的间充质细胞具备稳定的细胞标记物和生长状态,可用于各种治疗的临床试验。     

人脐带间充质干细胞对宫颈癌Hela细胞增殖的影响

目的 探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)对宫颈癌细胞生物学特性的影响.方法 分离培养脐带MSCs,将MSCs或其条件培养基与宫颈癌细胞Hela共培养,生长曲线、集落形成实验及RT-PCR分别检测MSCs细胞或条件培养基对Hela细胞增殖及凋亡相关基因表达的影响.结果 生长曲线结果显示,MSCs细胞及条件培养液可抑制Hela细胞增殖,并呈现一定的浓度依赖性.集落形成实验结果显示,MSCs条件培养液可抑制Hela细胞集落形成能力;RT-PCR结果显示,MSCs条件培养基促进Hela细胞P53、Bax及caspase-3基因表达,下调Bcl-2及survivin表达.结论 MSCs体外可促进宫颈癌细胞凋亡,抑制Hela细胞增殖.     

脐血源间充质干细胞治疗肌萎缩侧索硬化的临床研究

目的对脐血间充质干细胞（uMscs）治疗肌萎缩侧索硬化进行研究。方法将脐血间充质干细胞用腰穿的方法移植人肌萎缩侧索硬化患者的脑脊液中,术后给予鼠神经生长因子,比较患者治疗前后的变化。结果采用Norris评分量表,表明患者治疗前后的病情有显著改善,差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论脐血间充质干细胞对治疗肌萎缩侧索硬化有一定的临床效果。     

人脐血间充质干细胞体外分离、培养与鉴定

目的 建立体外分离和培养人脐血间充质干细胞的方法,并探讨脐血间充质干细胞是否具有与骨髓间充质干细胞相一致的免疫表型.方法 无菌条件下采集正常产胎儿脐血,用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs),采用贴壁培养法获得MSCs,体外培养并对其增殖进行观察.用流式细胞仪检测细胞周期状态和白细胞表面抗原.结果 来源于脐血的MSCs在含有15%胎牛血清和低糖DMEM培养基中可以贴壁,并表现为间充质样细胞;传3代后,此类细胞可以纯化、扩增;其细胞倍增时间为60h左右.流式细胞分析细胞周期显示大部分细胞(85%)处于G0/G1期;此类细胞稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD54、CD105,但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45.结论 脐血中可培养出非造血干细胞,其白细胞表面抗原表达与骨髓间充质干细胞有较强的一致性.     

半乳糖凝集素1在脐带来源间充质干细胞调控类风湿关节炎患者T细胞功能中的作用

目的：明确半乳糖凝集素1（galectin-1）在脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs）调控类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）患者T细胞功能中的作用。方法： 应用慢病毒构建galectin-1低表达的UC-MSCs,即UC-MSCs(Gal-1-),采用直接接触培养方式分别将UC-MSCs、UC-MSCs(Gal-1-)与RA患者的CD4+ T细胞共培养。设立阴性对照组（CD4+ T）、阳性对照组［CD4+ T培养过程中加入植物血凝素（phytohae-magg lutinin,PHA）2 mg/L］、UC-MSCs-CD4+ T共培养组、UC-MSCs(对照shRNA)-CD4+ T共培养组及UC-MSCs(Gal-1-)-CD4+ T共培养组。MTS法检测CD4+ T细胞增殖,ELISA方法检测共培养上清液中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factors α, TNF-α）水平,流式细胞术检测Th1/Th2/Th17细胞亚型。结果： UC-MSCs和UC-MSCs(对照shRNA)与CD4+ T细胞共培养组可显著抑制PHA诱导的CD4+ T细胞增殖及TNF-α表达,而UC-MSCs(Gal-1-)组对此无明显抑制作用。与阴性对照组（8.51%±2.04%）相比,UC-MSCs及UC-MSCs(对照shRNA)组可显著抑制Th1细胞分化（分别为4.83%±1.37%和5.13%±0.87%,P值分别为0.012和0.018）,而UC MSCs(Gal-1-)组对此无明显抑制作用（6.41%±0.96%,P=0.101）。与阴性对照组相比,UC-MSCs及UC-MSCs(对照shRNA)组可上调Th2并下调Th17比例,但差异并无统计学意义,UC-MSCs(Gal-1-)组的这一作用不明显。结论： UC-MSCs可抑制RA患者CD4+ T细胞的增殖、活化并可降低Th1细胞比例,但敲低galectin-1分子的表达后该作用减弱,提示galectin-1参与了UC-MSCs抑制RA患者CD4+ T细胞功能的过程。     

人脐带间充质干细胞在不同孔径聚碳酸酯膜上的生长及迁移

目的 观察人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)在不同孔径Transwell插件底部聚碳酸酯膜上的生长、迁移情况,探讨对hUCMSCs进行非直接接触式共培养诱导分化时选择适宜膜孔径Transwell插件的依据.方法 体外分离、培养hUCMSCs,以丝裂霉素C处理后接种于常用的0.4、3.0和8.0μm三种膜孔径的6孔板Transwell插件中,培养7 d,观察、计数三种孔径插件底部贴壁细胞,计算迁移率,并在扫描电镜下观察细胞在多孔膜上的生长、迁移情况.结果 培养7 d后,0.4、3.0和8.0μm三种插件内贴壁hUCMSCs的迁移率分别为0、1.8%、8.0%,0.4 μm孔径迁移率与其他两组相比差异有统计学意义(P＜0.01).扫描电镜下观察到细胞在3.0和8.0 μm孔径聚碳酸酯膜底面生长以及穿越微孔的现象,而在0.4μm孑L径膜则未发现.结论 3.0和8.0 μm孔径聚碳酸酯膜允许hUCMSCs迁移穿越,而0.4 μm孔径聚碳酸酯膜则不允许,或可利用其正反面进行近距离非直接接触式共培养诱导hUCMSCs分化.

Abstract：

Objective To observe the growth and migration of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs) on polycarbonate membrane with different pore sizes and explore the criteria of selecting optimal Transwell insert for indirect co-culture to induce the differentiation of hUCMSCs.Methods hUCMSCs were isolated in vitro and then expanded in culture medium.After the treatment of mitomycin C,the cells were seeded on porous membranes of 6-well-dish Transwell inserts with different pore sizes of 0.4,3.0 and 8.0 μm respectively.After culturing for 7 days,the cells were observed and counted on the bottom of each porous membrane.Then the calculation of migration ratio was performed.The growth and migration of hUCMSCs on porous membranes were also examined under scanning electron microscope (SEM).Results The migration ratios of hUCMSCs on membranes of 0.4,3.0 and 8.0 μm pore sizes were 0,1.8% and 8.0% respectively.The migration ratio of cells on 0.4 μm pore size membrane was statistically different from that of the other two pore size groups (P ＜ 0.01).Under SEM,a small portion of cells were growing on the bottoms of membranes and moving through the pores.But there was no cell movement through 0.4 μm pore size membrane.Conclusions hUCMSCs can migrate through the polycarbonate membranes of 3.0 μm and 8.0 μm pore sizes but not through the 0.4 μm one.Thus both sides of polycarbonate membrane of 0.4 μm pore size may be used for close indirect co-culture to induce the differentiation of hUCMSCs.