SP1调控PIWIL1基因启动子转录活性研究

目的 克隆转录因子SP1编码序列,构建真核表达质粒PCDNA3.1-SP1,并研究其对PIWIL1基因转录活性的影响。方法 RT-PCR法从正常人外周血总RNA中钓取SP1基因的编码序列,插入至真核表达载体PCNDA3.1（+）,酶切及测序鉴定重组质粒。Western blot法分别验证重组表达载体的在COS-7细胞中的表达效应。分别将活性最高的PIWIL1基因启动子报告基因截短体（即核心启动子区域）、活性最低的PIWIL1基因启动子报告基因截短体,与SP1重组质粒共转染COS-7细胞,利用Dual-Luciferase reporter assay system测定不同启动子活性区的PIWIL1基因转录活性的改变,同时应用光辉霉素A下调SP1的表达来进一步验证SP1对PIWIL1活性的影响。结果 酶切及测序鉴定结果显示SP1表达质粒构建成功,Western blot法结果表明重组SP1表达载体能有效表达于COS-7细胞,过表达SP1可明显提高PIWIL1不同活性区的启动子的活性（P<0.05）。结论 外源性SP1真核表达载体转染能有效表达于COS-7细胞,并对PIWIL1的转录活性起着上调的作用,提示SP1可能是PIWIL1转录活性的正调控元件之一。     

Tim-3基因rs10053538、rs10515746位点多态性与原因不明复发性流产的关系

目的探讨Tim-3基因启动子区rs10053538、rs10515746位点多态性与原因不明复发性流产的关系。方法收集148例原因不明复发性流产患者为研究对象,以153例正常妊娠者为对照。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法和特异性等位基因聚合酶链反应（AS-PCR）法分别检测rs10053538、rs10515746位点多态性,并取部分PCR产物作测序验证。结果原因不明复发性流产患者rs10053538位点GT＋TT基因型及T等位基因分布频率（10.1%和5.1%）与对照组（11.8%和6.5%）比较差异无统计学意义（χ^2=0.205,P=0.651;χ^2=0.592,P=0.441）。rs10515746位点GT＋TT基因型频率及T等位基因分布频率（6.8%和3.4%）与对照组（3.9%和2.0%）比较差异均无统计学意义（χ^2=1.201,P=0.273;χ^2=1.169,P=0.280）。结论 Tim-3基因启动子rs10053538、rs10515746位点多态性与原因不明复发性流产可能无相关性。     

胃肠道间质瘤伊马替尼耐药细胞株的建立及细胞凋亡的实验研究

目的 体外构建胃肠道间质瘤耐药细胞株GIST-882-IM,鉴定其生物学特性。方法 采用首剂大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法诱导胃肠道间质瘤细胞GIST-882对Imatinib耐药,建立耐药细胞株,CCK8法绘制细胞生长曲线,计算细胞的倍增时间及半抑制浓度IC₅₀,流式细胞仪检测GIST-882及耐药株GIST-882-IM细胞凋亡及细胞周期。结果 耐药株GIST-882-IM的倍增时间为58.95±1.56h,高于细胞株GIST-882 49.49±0.69h,GIST-882-IM IC₅₀=1.869±0.103μmol,GIST-882 IC₅₀=0.054±0.001μmol,其耐药指数为34.62（P<0.01）。耐药细胞株GIST-882-IM相对于GIST-882,凋亡受到抑制,24、48、72h其细胞凋亡率分别为1.97%±0.38%、2.87%±0.38%、4.40%±0.36%,GIST-882凋亡率分别为6.07%±0.96%、11.17%±0.64%、16.97%±0.12%。细胞周期分析,耐药细胞株的G₀/G₁期增加,S期、G₂/M期减少。结论 成功构建GIST882 Imatinib耐药细胞株,耐药细胞与非耐药细胞的生物学特性不同。这为下一步研究伊马替尼耐药机制和筛选伊马替尼耐药的替代靶向药物奠定基础。     

预防性覆膜食管支架用于早期食管癌内镜治疗的效果观察

目的观察预防性覆膜食管支架用于早期食管癌内镜治疗的效果。方法对35例早期食管癌及癌前病变患者行内镜黏膜下剥离术（ESD）,术中放置预防性覆膜食管支架,术后观察其疗效。结果所有患者均一次性置入支架成功,在第19~92天取出完整的支架,疗效良好。6例发生胸骨后疼痛和异物感,予以止痛对症处理后好转;3例术后出血,予以禁食制酸治疗后好转;4例发生向下移位,在内镜下重新调整到位;1例因无法耐受在术后第19天取出支架,后出现食管狭窄,予以探条扩张2次;3例支架脱落掉入胃腔,重新放置后再次脱落,分别在术后第25、29、41天取出支架;1例因反复呃逆4周而取出支架;6例支架上下缘肉芽组织增生,术后第8周取出支架。除了以上11例患者提早取出支架,其余24例患者约在术后90d取出支架,均有较好的食管塑形和黏膜愈合时间,均未再发食管狭窄。术后随访24个月,3例患者术后早期食管癌复发再行ESD,术后恢复良好。结论对早期食管癌患者行ESD时放置预防性覆膜食管支架,可以有效防止术后食管狭窄的发生,改善患者的生活质量。     

RNA干扰Gal-3表达抑制胰腺癌细胞增殖并促进其凋亡

目的探讨RNA干扰半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)表达对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制.方法将培养的Panc-1细胞随机分为对照组(未处理)、NC组(转染control-si RNA)和Gal-3干扰组(转染Gal-3-si RNA),以小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)技术干扰Panc-1细胞中Gal-3表达后,RT-PCR和Western blot检测干扰效果,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中ki67、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)抗体和β-连环蛋白(β-catenin)蛋白表达.结果与对照组相比,NC组中Gal-3 m RNA(0.99±0.08vs 1.01±0.06)和蛋白(0.36±0.03 vs 0.34±0.05)的表达差异不显著(P0.05),而Gal-3干扰组中Gal-3m RNA(0.38±0.02 vs 1.01±0.06)和蛋白(0.10±0.01vs 0.34±0.05)的表达均显著降低(P0.05);Gal-3干扰组细胞增殖能力减弱(24 h:0.55±0.03 vs 0.71±0.05;48 h:0.76±0.05 vs 0.97±0.06;72 h:1.08±0.06 vs1.32±0.09),G0/G1期细胞百分比升高(79.48±1.32 vs71.52±1.15),S期(14.26±1.08 vs 18.24±1.06)和G2/M期(6.21±0.78 vs 10.19±1.52)降低,凋亡能力增强(13.26±2.28 vs 5.82±0.35),与对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05);与对照组相比,Gal-3干扰组中ki67(0.24±0.02 vs 0.96±0.07)、CyclinD 1(0.26±0.03vs 0.88±0.09)和β-catenin(0.42±0.05 vs 0.87±0.05)蛋白的表达水平均明显降低,而Cleaved Caspase-3(0.70±0.06 vs 0.32±0.03)蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);NC组与对照组间各指标差异均无统计学意义(P0.05).结论 RNA干扰Panc-1细胞中Gal-3表达,可抑制细胞增殖并促进细胞凋亡,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关.