同位素稀释液相色谱串联质谱法测量血清未结合雌三醇的协作研究

目的用同位素稀释液相色谱串联质谱(ID-LC/MS/MS)候选参考方法进行实验室间血清未结合雌三醇(u E3)协作研究,通过该研究进一步确认方法的性能特征(正确度和精密度),并将该方法在国内参考实验室推广,推动u E3标准化进程。方法依据ISO/WD 15725-1和GB/T 6379标准,拟定我国血清u E3协作研究方案。协作研究分为两个阶段:初步试验和正式试验,共9家参考实验室参加。按要求收集5个浓度水平样品并进行均匀性评价,分发到9家参考实验室,要求每个样品每日重复测量5次,连续测量3 d。计算各实验室测量结果的偏移和精密度,用格拉布斯(Grubbs)检验和柯克伦(Cochran)检验识别离群值和离群实验室。根据合格实验室的结果计算靶值,并向离群实验室和偏出允许范围的实验室提供整改建议。结果样品均匀性评价:所有样品测量结果计算F值均小于F0.05(9,20)临界值,样品中u E3是均匀的。初步试验:Grubbs检验,1个实验室测量结果为离群值;Cochran检验,2个实验室检验结果为离群值。剔除离群值后计算靶值;2017E301为(22.08±0.24)nmol/L;2017E302为(33.46±1.67)nmol/L。2个实验室结果超出允许范围。正式试验:Grubbs检验,所有实验室测量结果均未检出离群值;Cochran检验,3个实验室数据出现离群值。剔除离群值后计算靶值,2017E303为(10.36±0.35)nmol/L,2017E304为(15.47±0.26)nmol/L,2017E305为(46.97±1.19)nmol/L;各实验室间测量结果不精密度分别为1.14%~2.21%、0.79%~1.93%、0.60%~2.09%,测量结果偏移分别为-6.18%~4.83%、-2.26%~2.39%、-4.19%~4.07%。结论通过组织开展协作研究,确认各参考实验室通过协作研究方案能够快速建立并运行u E3候选参考方法,除个别实验室外各实验室的检测性能满足预定要求(不精密度3.0%,偏移7.5%),进一步确认了该方法的性能和各实验室运行参考方法的能力。通过初步研究和正式研究对研究方案的各实验环节进行了验证和完善;推动了u E3项目参考方法在我国参考实验室的运行,为后续厂商试剂主校准品联合定值或标准物质研制搭建了平台,促进u E3项目的标准化。     

高效液相色谱串联质谱法测定血清非结合雌三醇的前处理研究

目的优化高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定血清游离雌三醇(uE3)的前处理方法。方法以活性炭吸附血清为研究基质,通过加入已知量的雌三醇(E3)标准品及E3-2-3-4-13 C3内标,在LC-20AD XR高效液相色谱系统和API 5500串联四级杆质谱仪上对E3检测的色谱条件、质谱条件及萃取条件等进行优化。结果色谱条件:选用菲罗门Knietex色谱柱(100.0mm×2.1mm,2.6μm);有机相为甲醇,水相为0.1mmol/L氟化铵水溶液,8min梯度洗脱。质谱条件:选用电喷雾(ESI)负离子模式和多反应监测(MRM)模式分析,选择质荷比(m/z)287→m/z 145作为E3的定量离子对,m/z 287→m/z 171作为定性监测离子对;选择m/z 290→m/z 148作为内标的定量离子对,m/z 290→m/z 174作为定性监测的离子对。萃取条件:萃取剂为正己烷/乙酸乙酯(50/50,v/v),样品与萃取剂的比例为1∶2,萃取率可达85.71%。结论 E3检测的色谱条件、质谱条件、萃取条件已得到全面优化,为后续建立LC-MS/MS测定人血中uE3的参考方法打下良好基础。     

雷公藤内酯醇衍生物对肝癌细胞增殖、凋亡的作用研究

目的研究新型雷公藤内酯醇（Triptolide,TPL）衍生物对正常肝细胞的毒性以及对肝癌细胞的增殖、凋 亡作用。方法通过对TPL 进行化学修饰,获得2 种新型衍生物：雷公藤内酯三醇（TP-3-OH）和丙烯酸雷公 藤甲素酯（TPO）。通过体外培养人胚胎肝细胞LO2 和肝癌细胞HepG2、Hep3B、SMMC-7721,分为DMSO 对 照组, TPL/TP-3-OH/TPO 低、中、高浓度组（25、50、100 nmol·L-1）。通过检测培养上清中乳酸脱氢酶（LDH） 的活性来评价TP-3-OH、TPO 对肝细胞的毒性;采用MTT 实验检测细胞增殖情况;采用流式细胞术及 Western Blot 法检测细胞凋亡及凋亡通路相关蛋白表达情况;采用划痕实验检测细胞迁移能力。结果与TPL 组比较,50、100 nmol·L-1 浓度条件下TP-3-OH、TPO 组的LO2 细胞培养上清中的LDH 活性明显降低（P＜ 0.05,P＜0.01）。与DMSO 对照组比较,TPO 中、高浓度（50、100 nmol·L-1）组的LO2 细胞增殖抑制率明显升 高（P＜0.05,P＜0.01）,TPO 低、中、高浓度（25、50、100 nmol·L-1）组的HepG2、Hep3B、SMMC-7721 肝癌 细胞增殖抑制率均明显升高（P＜0.05,P＜0.01）;TPO 高浓度（100 nmol·L-1）组的LO2、HepG2 和SMMC-7721 细胞的早期、晚期细胞凋亡率均明显升高（P＜0.05,P＜0.01）;TPO 中、高浓度（50、100 nmol·L-1）组SMMC- 7721、HepG2 细胞的cleaved-Caspase-3、cleaved-PARP 蛋白表达显著上调（P＜0.01）;TPO 中浓度（50 nmol·L-1） 组SMMC-7721 细胞的24 h 迁移率明显降低（P＜0.05）。结论经化学修饰获得的2 种新型TPL 衍生物对肝细 胞的毒性降低,其中TPO 具有抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡的作用。     

α-淀粉酶参考方法的建立及其性能评价

目的:建立检测血清α-淀粉酶的参考方法,并对其主要性能进行评价。方法:按照国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)推荐的α-淀粉酶活性测定的参考测量程序建立本实验室的参考方法;根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)系列文件(EP5-A2、EP15-A2、EP6-A)对参考方法的精密度、准确度、线性范围等性能进行评价。结果:建立的α-淀粉酶参考方法的精密度评价A、B2个水平样本变异系数均<1.0%。有证参考物质(IRMM/IFCC-456)均值为546.4U/L,均值与靶值的偏移为0.09%,在允许范围内。α-淀粉酶的最大线性范围为1412.5U/L,高于IFCC公布的最大线性范围(719.8U/L)。结论:α-淀粉酶参考方法已基本建立,精密度、准确度及线性范围等性能指标均符合方法要求,为我国参考实验室网络的建立以及临床应用提供了基础和参考。     

血小板计数参考方法的性能评价及临床应用

目的复现血小板计数的参考方法并应用于临床。方法根据国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的流式细胞术计数血小板的参考方法,在本实验室复现该参考方法;通过2家校准实验室赋值新鲜全血,对4台不同型号血液分析仪的血小板计数结果进行正确度验证,并对结果不满意的仪器进行校准。结果血小板计数参考方法检测高、中、低值标本PLT的不精密度(CV)分别为2.2%、2.0%、8.4%,PLT在21×109/L~794×109/L范围内线性良好(r2=0.998),标本在6 h内测定结果稳定,携带污染率为0.05%,正确度偏倚小于3%。正确度验证中,Mindray BC 6800、Sysmex XE-5000i和Sysmex XT 1800i血液分析仪细胞检测结果均在可接受限内,Sysmex XS 500i血液分析仪经校准后通过验证。结论复现了ICSH推荐的血小板计数参考方法,其性能符合要求;赋值新鲜全血用于临床血液分析仪的正确度验证具有可行性,且可用于仪器的校准。     

不同厂家校准品校准同一检测系统检验结果的实验研究

目的 观察不同厂家的校准品能否直接校准非配套的检测系统.方法 参考美国临床实验室标准化委员会的EP9-A2文件,以罗氏检测系统为目标检测系统(系统1),用罗氏C-fas、朗道校准品Level2和Level3分别与国内某一厂家生产的生化分析仪器、试剂和检测程序组成待评检测系统(系统2～4),然后用上述四个检测系统分别检测40份新鲜患者血清中的总胆红素(TBil)等10个项目,每个标本测定两次,结果取均值.计算待评检测系统(Y)与目标检测系统(X)之间的相对偏倚,以美国临床医学检验部门修正法规(CLIA'88)允许总误差的1/2为标准,判断检验结果的可比性.结果 系统2与系统1的TBil,DBil,ALP和CK具有可比性,其他项目不具有可比性.系统3与系统1的TBil和GGT具有可比性,其他项目不具可比性.系统4与系统1的Glu具有可比性,其他项目不具可比性.结论 不同厂家生产的校准品不能直接用于校准非配套检测系统,每一检测系统都必须具有自己的配套校准品.     

冰冻人血清α-淀粉酶催化活性浓度候选二级标准物质的研制

目的研制冰冻人血清α-淀粉酶催化活性浓度候选二级标准物质,作为量值传递的标准。方法参照JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》和JJF 1644—2017《临床酶学标准物质的研制》要求进行均匀性、稳定性、互换性评价;联合6家通过中国合格评定国家认可委员会(CNAS)认可的校准实验室对标准物质进行定值,评定其均匀性、稳定性和定值引入的不确定度,计算扩展不确定度。结果标准物质均匀性和稳定性均良好,互通性评价结果显示,4个常规检测系统的测量值均位于95%可信区间内。定值结果:水平1为(106.3±4.3)U/L(k=2),水平2为(268.1±7.9)U/L(k=2)。结论研制的冰冻人血清α-淀粉酶催化活性浓度候选二级标准物质标示值可靠,均匀性、稳定性较好,具有互换性。     

冰冻人血清尿素和肌酐国家二级标准物质的研制

目的联合使用同位素稀释液相色谱串联质谱及酶学参考方法研制冰冻人血清尿素、肌酐国家二级标准物质, 作为量值溯源的载体。方法参照JJF1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》和JJF 1006-1994《一级标准物质技术规范》的要求对候选物质进行均匀性、稳定性、互换性评价;联合广东省中医院、北京航天总医院、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司、迈克生物股份有限公司、北京利德曼生化股份有限公司、浙江美康生物科技股份有限公司的6家参考实验室采用国际检验医学溯源联合委员会推荐的同位素稀释液相色谱串联质谱法及酶学参考方法共同对标准物质进行定值, 计算不确定度。结果所研制标准物质均匀性的方差分析结果为P>0.05, 稳定性评价t值小于t(0.05)查表时的t值, 互换性评价结果位于4个常规检测系统测量值95%置信区间内, 最终定值结果为尿素:14.7 mmol/L, 扩展不确定度0.3 mmol/L(k=2), 肌酐:313.9 μmol/L, 扩展不确定度14.5 μmol/L(k=2)。结论成功研制的冰冻人血清尿素、肌酐二级标准物质标示值可靠, 均匀性、稳定性较好, 不同检测系...