临床分子生物学检验实习带教体会

目的临床实习是检验专业学生极其重要的一个学习环节,是学生把所学的理论知识应用到检验实践中的一个过程,在实习过程中学生的操作技能,以及合理运用理论知识分析问题、解决问题的能力得到培养,为顺利走向社会打下坚实的基础。因此,在有限的实习阶段,如何增强学生的检验综合素质是教学医院的重要课题。分子生物学检验是检验医学的重要分支,由于专业性强、技术要求高,稍有疏忽即可能造成严重后果。笔者结合自身分子生物学检验带教工作总结出了做好岗前培训,建立"无基因,无核酸"的意识;提高带教老师业务素质,落实岗位责任制;采用多种教学方法结合的方式等几点经验,旨在为带教老师提供一些启示。     

丙型肝炎病毒NS4B对YAP转录、表达、磷酸化及细胞内分布的影响

目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)细胞内荧光表达质粒,检测NS4B对Yes相关蛋白(YAP)转录、表达、磷酸化及细胞内分布影响。 方法根据现有含有HCV 1b型病毒NS4B完整基因的质粒设计NS4B的特异性扩增引物,扩增NS4B完整序列并构建NS4B荧光质粒,质粒转染进入HEPG2和293T细胞,通过Real-time PCR检测YAP基因转录水平;通过Western blotting检测YAP蛋白表达及磷酸化水平;通过激光共聚焦和核质分离实验检测YAP细胞内分布。 结果成功扩增出NS4B完整序列并构建其荧光质粒;Real-time PCR和Western blotting结果显示,NS4B并不影响YAP的转录和表达水平,但是能够调节其磷酸化水平;激光共聚焦和核质分离试验结果提示NS4B能够调节YAP在细胞质和细胞核内的比例。 结论HCV NS4B可能通过对YAP的影响发挥生物学功能。     

HPV16E7基因定向突变及表达产物免疫原性研究

目的对人乳头瘤病毒(HPV)16E7基因中与宿主Rb蛋白结合区域进行突变获得HPV16E7突变体(HPV16mE7)序列,原核表达获得HPV16mE7蛋白。方法采用分子克隆技术扩增野生型HPV 16E7基因,设计特异性引物对目的基因进行定点突变并构建表达质粒,转化进入原核表达体系并通过IPTG诱导表达,表达产物大小及纯度经十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,免疫原性经蛋白免疫印迹法(Western blot)鉴定。结果准确按照设计突变目的基因特定位点,SDS-PAGE显示获得高纯度目的蛋白,Western blot结果显示目的蛋白具有良好的免疫原性。结论成功对HPV16E7进行定点突变并获得纯度较高免疫原性良好的突变表达蛋白。     

NF2基因在丙肝病毒非结构蛋白4B调节细胞周期中的作用

目的在HEPG2细胞内观察丙肝病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)对神经纤维瘤病Ⅱ型(NF2)基因的影响及NF2在NS4B调节细胞周期中的作用。方法将细胞分为多组,其中3组对照,分别为无处理组、pCDNA3.1空质粒组和si-NF2 control组;3组作用组,分别为NS4B质粒组、NF2质粒组和si-NF2沉默基因组。每组经过转染、培养后收获细胞;RT-qPCR和Western blot检测细胞内相应基因转录及表达;流式细胞仪检测细胞周期。结果 NS4B可降低NF2转录水平(P0.01),同时NS4B的高表达和NF2的低表达对细胞周期具有相似的作用,及促进细胞周期向S期的转变;而NF2的高表达则使细胞周期停滞在G_0/G_1。结论 NS4B对NF2具有一定的调控作用,NF2可能参与NS4B调控细胞周期机制。     

补阳还五汤+针刺联合常规疗法治疗中风后偏瘫(气虚血瘀)临床观察

[目的]观察补阳还五汤+针刺联合常规疗法治疗中风后偏瘫(气虚血瘀)疗效。[方法]将130例院患者按病志号抽签方法随机分为两组。对照组65例胞二磷胆碱0. 5g+生理盐水100mL,1次/d,静滴。功能锻炼:抗痉挛体位摆放;坐立平衡训练,坐站转换训练;上下肢肌力训练等,30min/d。治疗组65例补阳还五汤(黄芪40g,当归尾6g,赤芍4. 5g,川芎、红花、地龙各3g,桑枝、姜黄、牛膝、杜仲、石菖蒲、郁金、远志、禹白附、僵蚕各5g),水煎400mL。1剂/d,早晚温服。针刺,取患侧曲池、内关、手三里、合谷、肩隅、足三里、阳陵泉、三阴交,穴位皮肤除消毒后,常规针刺,捻转补法,得气后留针30min,1次/d,5次/周;常规治疗同对照组。连续治疗4周为1疗程。观测临床表现、神经功能缺损程度评分、日常生活活动能力评分、不良反应。治疗1疗程(4周),判定疗效。[结果]NDS、ADL均有改善(P 0. 01),治疗组改善优于对照组(P 0. 01)。[结论]补阳还五汤+针刺联合常规疗法治疗中风后偏瘫(气虚血瘀),疗效满意,无严重不良反应,值得推广。     

重组人白介素1受体Ⅰ型细胞外基因在毕赤酵母的表达

目的 构建白介素1受体Ⅰ型细胞外基因(可溶性白介素1受体Ⅰ型,sIL-1R Ⅰ)的pPICZαA-sIL-1R Ⅰ重组表达载体,利用毕赤酵母表达技术表达sIL-IR Ⅰ蛋向.方法 采用RT-PCR技术扩增基因sIL-1R Ⅰ.经酶切连接构建重组质粒pPICZαA-sIL-IR Ⅰ,转化E.coli Stb13;阳性克隆经测序成功后,把pPICZαA-sIL-IR Ⅰ重组质粒电转入毕赤酵母菌株GS115,PCR对阳性克隆进行鉴定,以及对GS115转化子表型筛选.确定表型后,对重组菌株进行甲醇诱导蛋白表达.提取菌体蛋白和上清液进行Western blotting检测以鉴定蛋白表达属于菌内表达还是分泌表达.结果 pPICZαA-sIL-IR Ⅰ重组质粒构建成功;pPICZαA-sIL-IR Ⅰ成功电转入酵母菌GS115:转化子表型筛选结果为甲醇诱导缓慢型Muts:对培养上清和菌体蛋白进行Western blotting检测结果:上清没有检测到蛋白,在菌体内检测到蛋白.结论 成功运用毕赤酵母表达体系表达sIL-1R Ⅰ蛋白,为sIL-IR Ⅰ的研究和应用提供实验基础.     

HPV mE7刺激的DCs对宫颈癌小鼠模型的治疗研究

目的:研究人乳头瘤病毒(HPV)mE7蛋白刺激后的树突状细胞(DCs)对小鼠体内宫颈癌细胞的杀伤效果。方法:建立宫颈癌细胞TC-1的荷瘤小鼠模型。分离外周血单个核细胞并进行DCs纯化培养,用磷酸盐缓冲液(PBS)、DCs(DCs+PBS)和前期实验表达纯化的HPVm E7蛋白刺激的DCs(DCs+HPV mE7)分别对荷瘤小鼠进行细胞免疫,观察小鼠体内肿瘤生长并检测小鼠脾细胞对TC-1细胞的体外裂解率、IFN-γ及血清中IL-12表达水平。结果:植入小鼠皮下的TC-1细胞具有典型的肿瘤细胞特征。DCs+PBS组和DCs+HPV mE7组中脾细胞对TC-1细胞的体外裂解率及IFN-γ表达水平均高于PBS组(P0.01),DCs+HPV mE7组高于DCs+PBS组(P0.01);DCs+PBS组和DCs+HPV mE7组中IL-12表达水平高于PBS组(P0.01),前两组比较无显著差异(P0.05)。随着时间延长,小鼠体内的肿瘤体积逐渐增大,DCs+PBS组和DCs+HPV mE7组的肿瘤体积增长速度明显降低(从第12天开始,DCs组与PBS组比较均P0.01),DCs+PBS组和DCs+HPV mE7组的肿瘤增长速度无显著差异(P0.05)。结论:成功构建宫颈癌细胞TC-1的荷瘤小鼠模型。DCs对TC-1细胞瘤体的生长具有一定的抑制作用,但特异性抗原的刺激对促进DCs杀伤肿瘤细胞的作用有限。     

血清甘胆酸检测在肝脏疾病诊断中的临床意义

目的探讨肝脏疾病患者血清甘胆酸(CG)测定的临床意义。方法采用COBAS c501全自动生化分析仪对1 004例病毒性肝炎患者(病毒性肝炎组)、52例肝纤维化患者(肝纤维化组)、217例肝硬化患者(肝硬化组)、53例肝癌患者(肝癌组)和114例健康对照者(健康对照组)进行血清CG测定。结果不同肝脏疾病组CG水平均明显高于健康对照组,差异均有统计学意义(P0.05);其他常用生化指标,如天门冬氨酸氨基转移酶、γ-谷氨酰转肽酶、总胆汁酸(TBA)等在不同疾病组与健康对照组比较升高程度不同;TBA水平在病毒性肝炎组、肝纤维化组、肝硬化组、肝癌组中与CG均呈正相关(r=0.892、0.944、0.695、0.837,P=0.000);CG与其他常用生化指标比较,除在病毒性肝炎组受试者工作特征曲线下面积(AUC)低于AST外,CG在病毒性肝炎组、肝纤维化组、肝硬化组、肝癌组中的AUC均明显高于其他生化指标,各组CG的AUC分别为0.675、0.767、0.829、0.921,P=0.000,随着肝脏疾病严重程度增加,CG水平的诊断界值同样增高,病毒性肝炎组、肝纤维化组、肝硬化组、肝癌组CG诊断界值分别为1.82、1.83、2.26、2.28μg/mL。结论血清CG水平可作为肝细胞损害及严重程度判断的重要指标。     

ImageJ软件在重组质粒pET32a-CDK2中蛋白表达的应用

目的应用Image J软件探索细胞周期依赖性蛋白激酶2(CDK2)在重组质粒pET32a-CDK2中的蛋白表达条件。方法将重组质粒pET32a-CDK2转入表达菌株BL21(DE3),然后在不同时间点(0、1、2、3、4h)和不同浓度(0.5、1、2 mmol/L)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)下诱导表达目的蛋白CDK2,对CDK2采用SDS-PAGE法进行蛋白电泳,并应用Image J软件对电泳条带进行灰度分析。结果 CDK2诱导表达量在不同时间点差异有统计学意义(P0.001),其中0h与1h、2h、3h、4h诱导表达量的差异均有统计学意义(P=0.007,P0.001,P0.001,P0.001);1h与3h和4h诱导表达量的差异均有统计学意义(P=0.001);而2h和1h、3h、4h诱导表达量的差异均无统计学意义(均有P0.05);不同浓度IPTG下的CDK2诱导表达量差异无统计学意义(P=0.336,P=0.240,P=1.000)。结论根据Image J软件分析结果,采用0.5 mmol/L浓度IPTG 2h的条件,节约诱导时间和试剂用量。