基因芯片分型中荧光标记引物的多重扩增及试验优化

基因芯片技术以其平行高效多位点多态性分型的优势，在基础和临床研究中被广泛应用。然而，随着位点增多，扩增目的片段更繁琐，为了提高效率和降低成本，就需要在同一反应体系内进行多重扩增。而多重扩增的关键问题是，同一体系内引物对的最大化，并有效减少非特异扩增。目前，此环节可通过计算机辅助设计和尝试不同引物对组合解决。由于芯片分型以杂交信号强弱为检测指标，扩增片段要载有荧光剂，因此多重扩增必须考虑到荧光标记物——青色素（Cy3）的大分子位阻效应。但是，Cy3的存在不可避免地降低了PCR的效率，为此本研究对相关试验条件进行优化。     

7种立克次体甄别检测基因芯片方法的建立

目的：建立一种能同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片法。方法根据NCBI公开发表的7种立克次体的序列设计引物和探针,制备立克次体甄别检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增立克次体靶基因片段,标记的产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度、重复性。用实时荧光PCR法与芯片法分别检测莫氏立克次体梯度稀释的核酸,比较两种方法的灵敏度。制备双盲模拟样本,进一步评价芯片方法的准确性。结果该研究共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条立克次体属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片检测质粒DNA的灵敏度为1．5×102～3×103拷贝／反应,检测模拟样本的灵敏度为103～104拷贝／μl。实时荧光PCR法与芯片法检测结果一致,实时荧光PCR法比芯片法灵敏度高10倍。双盲模拟样本检测符合率为100％。结论成功建立了可同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片检测方法,为立克次体病的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的高通量检测手段。     

靶向反义硫代寡脱氧核苷酸抗病毒疗效的实验研究

目的 探讨靶向反义硫代寡脱氧核苷酸（asODN)在乙型肝炎（HBV）病毒转基因小鼠体内抗病毒疗效。方法 设计合成针对HBV pre-C/C基因的反义硫代寡脱氧核苷酸：5'-CATGCCCCAAAGCCAC-3'，并以半乳糖－多聚赖氨酸（Gal15-PLL)作肝靶向载体。将12只血清HBsAg,HBV DNA阳性的转基因小鼠等分为Gal15-PLL-asODN治疗组及生理盐水对照组。靶向反义硫代寡脱氧核苷酸以每天每克体重15μg剂量，尾静脉注射给药，共12d，对照组用同样体积生理盐水同样方法给药。结果 注射Gal15-PLL-asODN 6d后，血清HBsAg已有下降（P＜0．05）；12d时显著下降（P＜0．01），且血清HBV DNA转阴率为66．7％（4／6），肝组织免疫组织化学HBsAg,HBcAg阳性肝细胞数较对照组明显下降（P＜0．05）；而生理盐水对照组无明显变化。结论 靶向反义硫代寡脱氧核苷酸在转基因小鼠体内能抑制HBV复制与抗原表达。     

硫代寡核苷酸在小鼠体内脏器生物分布研究

探讨硫代寡核甘酸 (PSODN)在小鼠体内脏器生物分布。合成互补于乙型肝炎病毒pre -c/c基因的PSODN :5’ -CATGCCCCAAAGCCAC - 3’ ,用T4多核苷酸激酶进行 5’端3 2 P标记后 ,小鼠尾静脉给药 ,分别于不同时间点处死小鼠并取各脏器及血液 ,液相闪烁计数仪测放射性计数。PSODN在血中很快清除 ,半衰期约 1～ 2分钟 ;在所有脏器中 ,肝摄取量最高 ,30分时脏器放射性大小依次为肝 >肾 >肺 >心 >脾 >脑。随后 ,肝脏放射性逐渐降低 ,2 4小时后是所给药物的 2 93%。肝脏作为反义治疗的靶器官有现实意义 ,建议PSODN给药间隔为 2 4小时     

醛固酮对人胎儿心脏成纤维细胞增殖以及胶原表达的影响

目的:探讨人胎儿心脏成纤维细胞(FCFS)经不同浓度的醛固酮(ALD)干预后增殖的变化以及对细胞中I、III型胶原表达的影响。方法:采用胶原酶II消化法、差速贴壁法、差速脱壁法获取并纯化FCFS,在不同浓度醛固酮作用下,应用CCK-8活细胞计数试剂盒检测细胞的增殖率。应用RT-PCR方法检测细胞中I型胶原前胶原A1(COL1A1)和III型胶原前胶原A1(COL3A1)mRNA的变化,应用Western blot检测COL1A1、COL3A1蛋白表达的变化。结果:ALD可浓度依赖性促-进FCFS增殖;低浓度的ALD(10-9、10-8、10-7mol/L)可明显促进FCFS中COL1A1、COL3A1表达,而10-6mol/L的ALD没有明显作用,10-5mol/L的ALD甚至起到抑制作用。结论:ALD可促进FCFS的细胞增殖,其增殖程度随浓度升高而升高;ALD在一定浓度范围内可以促进COL1A1和COL3A1表达,高浓度ALD对两种分子表达具有抑制作用。     

多基因寡核苷酸芯片在胰腺癌及胰腺良性病变标本检测中的应用

目的 建立k-ras、p16、DPC4、p53基因寡核苷酸芯片对胰腺癌基因突变/缺失的检测系统并评估胰腺癌组织及胰腺良性疾病标本中多基因突变/缺失在临床检测中的应用.方法 采用双重或单独不对称PCR扩增16例胰腺癌组织及8例胰腺良性疾病标本中的目的 DNA.扩增产物加杂交液后与芯片进行杂交、清洗、扫描.结果 16例胰腺癌组织中12例可见k-ras突变,p16、DPC4、p53基因改变分别是7例.14例标本存在至少1个基因改变,其中5例标本存在1个基因改变,2例标本同时2个基因改变,4例标本存在同时3个基因改变,3例标本存在同时4个基因改变.8例胰腺良性疾病中只有3例显示k-ras、p16、p53、DPC4突变.结论 多基因芯片系统具有高度的灵敏性和准确性、快速简便、自动化程度高等优点,可同时检测胰腺癌k-ras、p16、DPC4和p53多个热点突变基因,可以高效地应用于胰腺癌基因突变的研究.     

bcr-abl基因检测寡核苷酸芯片的制备及分析

为了研究bcr-abl融合基因检测芯片在白血病诊断、分型、治疗方案选择及预后判断中的应用价值，设计了融合基因检测探针，制戍寡核苷酸芯片；采用逆转录方法、荧光标记白血病细胞cDNA并进行杂交，以检测白血病细胞中bcr-abl基因。结果表明：通过对不同杂交温度、洗涤条件等的探索获得了较好的反应条件并用制备的芯片检测出了细胞株中的bcr-abl融合基因。结论：应用寡核苷酸芯片检测白血病细胞bcr-abl融合基因有独特的优势，具有一定的临床应用价值，但也存在一定的不足，若对芯片进一步改进，则今后在血液病方面应用前号是非常广阔的。     

基于表面增强拉曼散射的血清指纹谱检测方法研究

目的：对基于表面增强拉曼光谱检测血清指纹谱的试验条件进行优化。方法以正常人血清为例,银胶溶液为活性基底,分别检测不同血清用量（2．5～500μl）、不同孵育时间（10～30 min）、不同孵育温度（4℃、室温、37℃）及不同血清处理方法（萃取、去蛋白）的增强拉曼信号。结果及结论血清用量不宜超过50μl,与增强基底材料的比例1∶1到5∶1均适宜;孵育时间在10～30 min均可;孵育温度为4℃、室温、37℃均可;血清直接与增强基底混合信号效果极强,进行萃取和去蛋白处理后,拉曼信号会减弱。     

腹泻病毒化学发光基因芯片检测方法的建立和验证

目的 建立一种化学发光基因芯片检测方法,实现7种腹泻病毒,A组轮状病毒、B组轮状病毒、Ⅰ型诺如病毒、Ⅱ型诺如病毒、札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒的快速、准确检测.方法 选择7种病毒特异性基因的保守区,设计引物与探针,制备寡核苷酸基因芯片.将多重实时荧光PCR(RT-PCR)扩增产物与带有特异性探针的芯片杂交,经洗涤、化学发光检测后进行结果分析.在优化的RT-PCR体系、杂交条件和化学发光检测条件下,评价芯片的灵敏度、重复性和特异性.结果 研制的基因芯片具有良好的特异性和灵敏度,检测体外转录RNA参考品的最低检测限为3×103拷贝/反应,检测临床样本的灵敏度为95.2％、特异性为92.1％、符合率为95.1％.结论 建立了一种基于化学发光基因芯片的腹泻病毒检测方法,此法能快速、灵敏、特异地检测和鉴别7种腹泻病毒,具有较好的应用前景.     

HCV脱氧核酶在荧光素酶表达细胞中活性的初步观察

脱氧核酶 (ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅ ,ＤＲｚ)是具有生物催化活性的小分子酶性ＤＮＡ(ｃａｔａｌｙｔｉｃＤＮＡ) ,能定点剪切ＲＮＡ分子 ,其活性中心系所谓 10～ 2 3基序 (ｍｏｔｉｆ)。本研究对丙型肝炎病毒 (ＨＣＶ)靶向性ＤＲｚ、硫代修饰的ＤＲｚ (ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅｓ,ＴＤＲｚ)和突变硫代ＤＲｚ(ｍｕｔａｎｔｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅＤＲｚ,ＭＤＲｚ)在靶基因调控性荧光素酶表达细胞中的活性进行了初步观察。ＤＲｚ、ＴＤＲｚ、ＭＤＲｚ由上海Ｓａｎｇｏｎ公司合成。ＨｅｐＧ2…