应用聚合酶链反应技术快速诊断腹水中大肠杆菌感染

应用聚合酶链反应技术快速诊断腹水中大肠杆菌感染陈乃玲童贻刚苑公忍顾芳田惠英韩春风贾克明作者单位：北京１００７００北京军区总医院解放军肝病研究所目前国内外对腹水感染的诊断主要依靠细胞数检测、生化分析、鲎试验及细菌培养，利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术尚未...     

HBV的小鼠模型研究进展

乙型肝炎病毒感染是全球范围内影响人类健康的重要问题,目前人们对HBV及其所致疾?膊 病有了相当深入的认识.但由于缺乏合适的动物模型,乙型肝炎病毒的生物学研究和治疗进展缓慢.小鼠作为一种实验室常用的动物,遗传免疫背景清楚明确,已经成为人们研究乙肝的重要工具.本文简要综述了小鼠模型在乙型肝炎研究中的进展.     

丙型肝炎病毒体外培养细胞模型研究进展

由于丙型肝炎病毒(HCV)的高度变异性以及缺乏高效率的细胞培养体系,人们对HCV生活史的认识、对相关疫苗和特异性抗病毒药物的研究进展缓慢.寻找高效率的HCV体外细胞培养体系一直是HCV研究的重点,现就近年来在相关领域的研究进展作一综述.     

新广谱大肠杆菌噬菌体IME11的分离及鉴定

目的 分离广谱大肠杆菌噬菌体并对其进行种属的鉴定。方法 以不同种临床致病性大肠杆菌为指示菌,从未经处理的污水样品中分离噬菌体;采用蛋白酶K/SDS的方法提取噬菌体基因组,制备重组载体,将阳性重组质粒进行测序;将测序结果进行BLAST,推测该噬菌体种属分类位置。结果 分别以大肠杆菌E1 ～ E17共17种细菌作为指示菌,成功分离出一种广谱噬菌体,可裂解31株临床分离致病性大肠杆菌中的13株,并将其命名为IME11;由噬菌体基因组限制性酶切片段分析表明其遗传物质为dsDNA;将噬菌体IME11基因组的2个随机片段测序结果进行BLAST,推测其属于N4-like噬菌体属。结论 分离出了一种广谱噬菌体,在分类学上属于N4-like噬菌体属。     

人血管生成素-1真核表达载体的构建与表达

目的构建人血管生成素-1的真核表达载体,真核表达人血管生成素-1蛋白并进行纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）将人血管生成素-1基因片段插入B7载体中构建真核表达载体,通过转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行真核表达。结果成功构建了B7Ang-1真核表达载体,在CHO细胞中进行了稳定表达,获得了纯化的人血管生成素-1蛋白。结论真核系统表达的人血管生成素-1蛋白具有良好的抗原性,为进一步的生物活性研究和临床应用奠定了基础。     

基孔肯雅病毒中和表位的筛选及表达

目的:寻找基孔肯雅病毒中和表位,并将其表达为重组融合蛋白.方法:对噬菌体展示12肽库进行了生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆,使用 ELISA方法筛选并鉴定阳性克隆,分析阳性克隆的DNA序列,将其翻译成氨基酸序列进行同源性比较.将其中一个表位连同M13噬菌体PⅢ蛋白结构域Ⅰ～Ⅱ的编码序列用PCR技术扩增后插入原核表达载体pQE30,用IPTG诱导融合蛋白表达.结果与结论:从经过3轮淘洗的噬菌体中随机挑选123个克隆,从中筛选到20个阳性克隆,其中包含7种不同的氨基酸序列,这些序列缺乏同源性,表明该单抗表位应为构象型表位.在室温培养条件下成功地在大肠杆菌周质腔表达了一种可溶性的表位融合蛋白,经亲和层析得到了纯化的表位融合蛋白.     

用于大容量人源天然噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定

目的构建一个应用于大容量Fab段天然噬菌体抗体库的表达载体。方法用定点突变技术将表面呈现噬菌粒载体pDF上的BssHⅡ酶切位点改为BglⅡ酶切位点,然后分别在抗体轻链和重链位置插入自杀基因SacB,构建含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB;利用抗乙肝表面抗原抗体的基因为模板,PCR扩增重链和轻链基因片段。将PCR扩增的轻链基因和重链基因分别插入载体pDF-D-SacB内,利用电转化的方法将其转入Trans1-Blue大肠杆菌,构建2个初级质粒,再利用初级质粒超感染BSl365菌,使其轻链与重链发生重组,获得重组质粒,进一步获得抗乙肝表面抗原抗体的噬菌体。之后利用该噬菌体感染大肠杆菌Trans1-Blue进行扩增,得到大量抗乙肝表面抗原的噬菌体抗体。最后,通过酶联免疫吸附剂测定检测所获得的抗体。结果通过向pDF重轻链区域插入SacB基因,改造抗体基因克隆位点,构建了pDF-D-SacB载体;经检测,pDF-D-SacB可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,可以在分泌Cre蛋白酶的细菌胞内发生预期的Cre-Loxp介导的定点重组。结论所获得的含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB适用于构建大容量噬菌体抗体库。     

应用随机PCR技术制备靶基因文库随机片段

目的　用随机PCR技术制备构建靶基因文库的随机基因片段。方法　先扩出靶基因 (HIV1Envgp160 )片段 ,然后设计两条引物 ,1条为锚定随机引物用于扩出靶基因的随机片段 ,另 1条为锚定特异引物用于对随机片段进行扩增 ,得到大量的随机片段 ;优化模板量、dNTP浓度、反应时间、温度和DNA聚合酶等反应条件 ,扩出靶基因的随机片段。结果　得到用于建库的理想靶基因随机片段。结论　随机PCR是制备靶基因文库随机片段的一个简便有效方法。     

野外采集标本中人埃立克体16S rRNA基因扩增方法及应用

本文应用特异引物,通过多对半巢式PCR从采自内蒙古大兴安岭的蜱标本中扩增出人粒细胞埃立克体和查菲埃立克体的16SrRNA全基因,一方面提供了这2种埃立克体存在于中国的证据,另一方面为今后进行埃立克体病的病原、媒介和宿主的调查研究提供了一个可行的方法.并从一只大林姬鼠的脏器中检测到EC16SrRNA基因片段.     

人源抗-HBsAg-干扰素融合蛋白在CHO细胞中的表达

目的 尝试用抗体工程技术研制乙型肝炎导向干扰素。方法 利用PCR技术进行体外重组,将α－2b干扰素（IFN－α2b）基因分别与抗－HBsAg人源抗体的轻链及重链Fd基因融合,IFN－α2b基因位于融合基因的3′端,为避免干扰素结构域与抗体结构域在空间上互相影响,在二者之间引入一条15个氨基酸的柔性短肽。分别构建上述融合肽链的CHO表达质粒（轻链－IFN表达质粒pLIC以 DNA3.1( )为载体,重链Fd-IFN表达质粒pFID以pCdhfr1为载体）,表达质粒以下述三种组合转染CHO（dhfr-）细胞：Ⅰ,pLIC pHFD;Ⅱ,pLIC pFID;Ⅲ,pLFC pFID。其中pLFC为抗－HBsAg轻链全长表达质粒,pHFD为抗－HBsAg重链全长表达质粒。结果 Ⅰ组和Ⅱ组上清液具有干扰素活性,但仅Ⅰ组具有HBsAg结合活性。结论 用基因工程的手段成功地在CHO细胞中表达了具有HBsAg结合能力的融合干扰素分子。