miR-513a-5p慢病毒载体的构建及其对人骨肉瘤细胞放疗敏感性的影响

目的:构建miR-513a-5p慢病毒过表达载体，转染人骨肉瘤细胞株，观察miR-513a-5p对人骨肉瘤细胞放疗敏感性的影响。方法:PCR法扩增人miR-513a-5p基因，克隆入pLentis-CMV-GFP-MCS-PGK-PURO载体获得重组质粒pLentis-miR513a，双酶切鉴定并测序后将正确的重组质粒和对照质粒转染293FT细胞制备慢病毒，分别转染骨肉瘤HOS和U2OS细胞，qRT-PCR法及荧光显微镜鉴定转染结果。克隆形成实验、MTT法检测miR-513a-5p高表达HOS和U2OS细胞在X射线照射下细胞存活情况。结果:双酶切及测序结果确定成功构建miR-513a-5p慢病毒载体pLentis-miR513a。qRT-PCR结果提示，转染骨肉瘤细胞株后miR-513a-5p表达显著升高。克隆形成实验结果显示miR-513a-5p高表达后骨肉瘤细胞在X射线照射下细胞增殖减慢。MTT结果提示miR-513a-5p高表达骨肉瘤细胞经X射线照射后细胞存活减少。结论:成功构建了miR-513a-5p慢病毒载体，建立了高效稳定表达miR-513a-5p的骨肉瘤细胞株，高表达miR-513a-5p能显著增加X射线照射后骨肉瘤细胞的放疗敏感性。     

加味天麻钩藤饮对SHR模型大鼠血管内皮功能障碍及神经因子影响分析

目的:分析加味天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠(SHR)模型大鼠血管内皮功能障碍(ED)影响。方法:选取雄性SHR大鼠40只,16周龄,平均体重(328. 31±25. 71) g,依据随机数字表法将其分成两组,观察组(20只),对照组(20只),观察组将加味天麻钩藤饮加入蒸馏水溶解,1. 33ml/100g灌胃,每天一次;对照组使用等剂量饮用水灌胃,每天一次;大鼠连续干预13周后处死,检测大鼠心率及颈动脉血压、24小时尿蛋白定量、内生肌酐清除率(Ccr)、血管内皮标志物和脑组织神经生长因子(NGF)与闹源性神经生长因子(BDNF)表达状况。结果:血清NO与24小时尿蛋白排泄量为负相关性(r=-0. 793,P0. 05),血清ET-1和24小时尿蛋白排泄量无相关性(r=0. 061,P0. 05),循环NO/ET-1和24小时尿蛋白排泄量为负相关性(r=-0. 846,P0. 05);观察组大鼠脉压低于对照组,差异有统计学意义(P0. 05);观察组大鼠尿蛋白定量、血浆ET-1水平低于对照组,差异有统计学意义(P0. 05);血清NO水平低于对照组、循环NO/ET-1高于对照组,但差异无统计学意义(P0. 05);观察组大鼠脑组织内NGF、BDNF免疫阳性细胞数高于对照组,差异有统计学意义(P0. 05)。结论:ED和高血压前期肾损伤有一定联系,加味天麻钩藤饮可改善SHR大鼠血浆ET-1含量和内皮依赖性收缩能力,提升受损脑组织神经再生作用,对血管内皮和脑组织神经有保护影响。     

miRNA-122a靶基因预测及生物信息学分析

目的:利用基因芯片技术分析肝癌HepG2细胞和正常肝上皮LO2细胞中miRNA的表达,并对HepG2细胞中低表达的miRNA-122a进行靶基因预测及相关生物信息学分析,为以miRNA-122a为靶点的基因治疗提供理论和实验基础.方法:利用基因芯片技术检测HepG2细胞和LO2细胞中miRNA-122a表达水平,通过生物信息学预测miRNA-122a的靶基因,并对其靶基因进行功能富集分析(GO-analysis)、信号转导通路富集分析(Pathway-analysis)和蛋白质相互作用网络分析.结果:与LO2细胞比较,miRNA-122a在HepG2细胞中呈低表达.miRNA-122a预测靶基因有1 104个,其靶基因集合功能分别富集于碳水化合物生物合成、核苷酸代谢、细胞因子受体结合、细胞周期等生物学过程(P<0.001);信号转导通路显著富集于JAK-STAT信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、ErbB信号通路、细胞周期等信号转导通路(P<0.001).结论:miRNA-122a在HepG2细胞中呈现低表达,miRNA-122a预测靶基因集合显著富集在与肿瘤发生相关的信号通路中.     

兔抗人APE1多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备兔抗人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶多克隆抗体并进行鉴定.方法:以纯化的全长APE1蛋白为抗原, 采用改良的快速免疫法制备兔抗人APE1多克隆抗体并进行特异性亲和纯化, ELISA、Western blot和免疫组化检测制备抗体的效价和特异性.结果:ELISA检测显示该抗体的效价达到1:128 000, 相对亲和力常数为8.96×10-6 mol/L.Western blot显示该抗体能与APE1蛋白特异性结合, 免疫组化检测显示阳性反应产物主要定位于细胞核.此外, 该抗体还可用于小鼠和大鼠组织APE1蛋白的检测.结论:制备的多克隆抗体特异性和效价良好, 不仅为今后深入研究人APE1蛋白的性质与功能提供了有用的实验工具, 还可用于检测小鼠和大鼠组织中APE1蛋白的表达.     

肿瘤转移抑制基因Nm23-H1融合蛋白的表达纯化及其功能的初步研究

目的 利用人Nm23-H1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,并对蛋白其活性进行初步分析.方法 将重组质粒pET28a-Nm23-H1转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用金属螯合层析技术进行蛋白纯化,得到Nm23-H1融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot鉴定纯化蛋白,并用RP-HPLC法、电泳迁移率变动分析实验检测Nm23-H1融合蛋白的核苷二磷酸激酶(NDPK)活性及核酸内切酶(AP)修复活性.结果 转化溶原菌后能够表达目的 蛋白,蛋白表达量高,为可溶性蛋白.Ni2+柱纯化后得到Nm23-H1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.RP-HPLC法就及电泳迁移率变动分析实验证明所纯化的Nm23-H1融合蛋白具有NDPK活性,不具有AP修复活性,但可以增加APE1蛋白的AP修复活性.结论 利用原核表达载体pET28a-Nm23-H1在E.coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到具有NDPK活性,但无AP修复活性的Nm23-H1融合蛋白,此蛋白可以增强APE1蛋白的AP修复活性,共同参与细胞的DNA损伤修复.     

miR-424慢病毒表达载体的构建及其对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：构建hsa‐miR‐424基因慢病毒表达载体,并鉴定miR‐424在细胞内表达水平,研究hsa‐miR‐424对宫颈癌 He‐la 细胞增殖的影响。方法以人基因组 DNA 为模板,设计合成 miR‐424的上下游引物,PCR 扩增目的片段,回收产物将其连入pMD18T 载体中,进行测序。再以 pMD18T‐miR424为模板进行 PCR 扩增,将其中表达 pMD18T‐miR424的结构经酶切后插入pLentis‐CMV‐GFP‐MCS‐PGK‐PURO 载体,构建成 pLentis‐CMV‐GFP‐miR424‐PGK‐PURO ,在293T 细胞中与 pSPAX2、pMD2．G包装产生所需的慢病毒,再用含慢病毒的上清液感染 Hela 细胞。结果 miR‐424基因与慢病毒载体连接成功,测序结果证明了插入到质粒载体中的 miR‐424前体序列完全正确,成功构建 pLentis‐CMV‐GFP‐miR424重组慢病毒载体,用其感染宫颈癌Hela 细胞后上调 miR‐424的表达近60倍。采用 M TT 法检测增殖结果提示：感染 miR‐424慢病毒的宫颈癌 Hela 细胞株均存在细胞增殖减慢。结论成功的构建了 miR‐424慢病毒载体,建立了高效稳定表达 miR‐424的细胞株,并用含慢病毒的上清液感染宫颈癌 Hela 细胞,成功抑制了 Hela 细胞的增殖,为后续相关的研究奠定了良好的基础。     

药物流产联合B超引导下清宫治疗过期流产的临床观察

目的 探讨药物流产联合B超引导下清宫术治疗过期流产的临床效果.方法 选择我院2011年1月至2012年7月收治的过期流产患者212例.随机分为观察组（药物流产联合超声医师行B超引导下清宫术）和对照组（药物流产＋常规清宫术）,比较两组的术中清宫时间、出血、术后出血等情况.结果 药物流产联合B超引导下清宫治疗过期流产具有手术操作时间短、损伤小、术后并发症少等优点,患者易接受,是一种较为理想的治疗方法.     

Avastin抑制骨肉瘤裸鼠模型血管生成实验研究

目的 观察Avastin抑制骨肉瘤裸鼠移植瘤血管生成并探讨其作用机制.方法 人骨肉瘤细胞9901荷瘤裸鼠12只随机分为3组:对照组、Avastin低剂量组(2mg·kg-1·w-1)和Avastin高剂量组(5mg·kg-1·w-1),每周瘤内注射1次,共治疗2次,治疗过程中观察肿瘤生长情况.治疗后处死裸鼠,计算抑瘤率,并通过病理组织学观察、免疫组织化学和激光共聚焦观察肿瘤内微血管密度、坏死、增殖、凋亡和肿瘤细胞缺氧情况.结果 Avastin低剂量治疗组和Avastin高剂量治疗组的抑瘤率分别为32.87%、39.81%;对照组、Avastin低剂量治疗组和Avastin高剂量治疗组3组坏死的比例分别为2.01%、11.49%和12.15%.Avastin低剂量治疗组和Avastin高剂量治疗组的微血管密度及增殖指数明显低于对照组(P<0.05),凋亡指数明显高于对照组(P<0.05),但Avastin低剂量治疗组和Avastin高剂量治疗组的微血管密度、增殖指数和凋亡指数差异无统计学意义(P>0.05).EF-5和CD31免疫荧光双标激光共聚焦显微镜观察显示Avastin治疗组血管密度降低、组织缺氧加重.结论 Avastin能显著抑制骨肉瘤的血管生成和肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡,进而显著抑制裸鼠原位肿瘤的生长.     

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶单克隆抗体抗原表位的鉴定及应用

目的:研究鉴定人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶单克隆抗体(hAPE1 mAb)的抗原表位,并建立定量检测hAPE1的ELISA一步法。方法:设计并合成APE1-15肽阵列,鉴定hAPE1 mAb 2-G1和4-F6的抗原表位,应用三维立体结构观察软件Molsoft.ICM-Pro模拟hAPE1 mAb抗原表位的立体结构;采用改良的过碘酸钠法标记抗体,以hAPE1 mAb为捕获抗体和酶标抗体,建立hAPE1的ELISA一步检测法。结果:APE1-15肽阵列检测结果和抗原表位三维结构显示,2-G1mAb的抗原表位对应为hAPE1天然蛋白氨基酸残基序列的76-90位和109-123位,位于氧化还原区域,为构象型抗原表位;4-F6 mAb的抗原表位对应为hAPE1天然蛋白氨基酸序列的109-147位,位于DNA修复内切酶活性区。ELISA一步法检测hAPE1蛋白的线性范围为8.0~200μg/L,最低检测限为2.0μg/L。平均批内变异系数为8.67%,平均批间变异系数为12.45%,平均回收率为105.47%。结论:hAPE1 2-G1 mAb和4-F6 mAb具有不同的抗原表位,成功建立的hAPE1 ELISA一步法为简便、快速、准确检测血清中hAPE1的含量奠定了基础。     

DWI／MRI在急性脑梗死诊断中的表现及价值

目的探讨磁共振弥散加权成像（DWI）技术对于急性脑梗死的诊断应用价值。方法回顾性分析42例急性梗死患者的临床及MRI（T1WI、T2WI、FLAIR、DWI序列）的影像学表现。结果45例急性脑梗死患者共检出病灶53个，其中45个为新发责任病灶，7个为陈旧病灶。新发责任病灶中，T2WI显示病灶35个，阳性率76．09％。T1WI显示病灶33个，阳性率71．74％；T2WI不能判断病灶的发生时间；DWI显示病灶46个，阳性率100％。7个陈旧病灶均呈长T1长T2信号，FLAIR高信号，DWI未见信号改变。结论DWI技术在急性梗死的部位以及判断病程方面，较常规MRI优越。