PCR-CTPP在DNA 碱基切除修复基因SNP分型中的应用

目的：分析两对引物‐聚合酶链式反应（PCR‐CTPP）在碱基切除修复（BER）途径基因单核苷酸多态性（SNP）分型中的应用,为发现新的SNP检测方法提供实验依据。方法采用PCR‐CTPP扩增BER途径关键蛋白OGG1、XRCC1及APE14个常见SNP位点OGG1 Ser326Cys、XRCC1 Arg399Gln、APE1 Asp148Glu及‐141T／G（位于启动子区域）的DNA片段,凝胶电泳显像后判读基因型,同时与DNA测序的方式比对各基因位点的准确性。结果 PCR‐CTPP方法基因分型结果与DNA测序得到的基因分型结果完全一致。结论 PCR‐CTPP技术可靠、快速,其广泛应用能够有助于基因SNP的分型研究。     

APE1在宫颈癌的表达及其与锎-252中子放疗预后的关系

目的探讨脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶（APE1）基因在宫颈癌中的表达情况及其与临床病理和锎-252中子放射治疗预后的关系。方法应用免疫组织化学法检测10例正常宫颈组织、15例子宫颈上皮内肿瘤（CIN）组织、89例宫颈癌组织（接受锎-252中子刀放疗）中APE1的表达,并分析其与宫颈癌临床病理及患者预后的关系。结果宫颈癌组织APE1表达水平明显高于正常宫颈组织和CIN病例（P〈0．01）。APE1在正常宫颈组织和CIN病例均呈胞核表达,宫颈癌组织中APE1呈胞核表达（59例）、单纯胞浆表达（8例）或核浆共同表达（22例）。APE1表达强度与宫颈癌FIGO分期、病理分级和淋巴结转移情况有关（P〈0．05）,与年龄和病理分型无关。APE1亚细胞定位情况与FIGO分期、病理分级有关（P〈0．01）,与淋巴结转移情况无关。生存分析显示在APE1核表达组（中位生存时间70．9月）和APE1低表达组（中位生存时间75．8月）的生存时间明显长于APE1浆表达组（中位生存时间57．8月）和APE1高表达组（中位生存时间56．5月）（P=0．025,0．001）。结论APE1胞质异位表达可能与宫颈癌的发生、发展相关,APE1亚细胞定位和表达水平对锎-252中子放射治疗宫颈癌的疗效有提示作用。     

Avastin抑制骨肉瘤裸鼠模型血管生成实验研究

目的 观察Avastin抑制骨肉瘤裸鼠移植瘤血管生成并探讨其作用机制.方法 人骨肉瘤细胞9901荷瘤裸鼠12只随机分为3组:对照组、Avastin低剂量组(2mg·kg-1·w-1)和Avastin高剂量组(5mg·kg-1·w-1),每周瘤内注射1次,共治疗2次,治疗过程中观察肿瘤生长情况.治疗后处死裸鼠,计算抑瘤率,并通过病理组织学观察、免疫组织化学和激光共聚焦观察肿瘤内微血管密度、坏死、增殖、凋亡和肿瘤细胞缺氧情况.结果 Avastin低剂量治疗组和Avastin高剂量治疗组的抑瘤率分别为32.87%、39.81%;对照组、Avastin低剂量治疗组和Avastin高剂量治疗组3组坏死的比例分别为2.01%、11.49%和12.15%.Avastin低剂量治疗组和Avastin高剂量治疗组的微血管密度及增殖指数明显低于对照组(P<0.05),凋亡指数明显高于对照组(P<0.05),但Avastin低剂量治疗组和Avastin高剂量治疗组的微血管密度、增殖指数和凋亡指数差异无统计学意义(P>0.05).EF-5和CD31免疫荧光双标激光共聚焦显微镜观察显示Avastin治疗组血管密度降低、组织缺氧加重.结论 Avastin能显著抑制骨肉瘤的血管生成和肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡,进而显著抑制裸鼠原位肿瘤的生长.     

miRNA-122a靶基因预测及生物信息学分析

目的:利用基因芯片技术分析肝癌HepG2细胞和正常肝上皮LO2细胞中miRNA的表达,并对HepG2细胞中低表达的miRNA-122a进行靶基因预测及相关生物信息学分析,为以miRNA-122a为靶点的基因治疗提供理论和实验基础.方法:利用基因芯片技术检测HepG2细胞和LO2细胞中miRNA-122a表达水平,通过生物信息学预测miRNA-122a的靶基因,并对其靶基因进行功能富集分析(GO-analysis)、信号转导通路富集分析(Pathway-analysis)和蛋白质相互作用网络分析.结果:与LO2细胞比较,miRNA-122a在HepG2细胞中呈低表达.miRNA-122a预测靶基因有1 104个,其靶基因集合功能分别富集于碳水化合物生物合成、核苷酸代谢、细胞因子受体结合、细胞周期等生物学过程(P<0.001);信号转导通路显著富集于JAK-STAT信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、ErbB信号通路、细胞周期等信号转导通路(P<0.001).结论:miRNA-122a在HepG2细胞中呈现低表达,miRNA-122a预测靶基因集合显著富集在与肿瘤发生相关的信号通路中.     

血清多肿瘤标志物判别方程建立及其对肺癌诊断及分类的意义

目的 探讨多肿瘤标志物联合检测系统在肺癌诊断及分类中的意义,并建立判别方程,以提高诊断正确率.方法 对601例肺癌患者、88例肺部良性疾病患者及1 203例正常体检者的12种常见肿瘤标志物检测结果及临床资料进行回顾性研究,通过Fisher二分类判别分析建立判别诊断及三种主要病理学类型分类方程.结果 单项指标中CEA、CA125和CA242阳性率分别为40.93%、29.78%和13.48%,与肺部良性疾病组和正常人群阳性率差异有统计学意义(P＜0.001),其中CEA对肺癌诊断差异有统计学意义(P＜0.001).建立肺癌诊断判别方程及分类诊断方程,其中肺癌诊断符合率为89.10%,同时分类诊断符合率为86.10%(鳞癌),92.10%(腺癌)和95.60%(小细胞肺癌)均显著高于其对应的多项指标累加的诊断正确率及CEA单项诊断正确率(P＜0.01).结论 肺癌诊断及分类方程有助于临床对多肿瘤标志物意义的理解,能够有效提高肺癌及分类诊断的正确率,有推广应用价值.     

血卟啉衍生物介导的光动力疗法对人肺腺癌细胞杀伤效应的实验研究

目的研究血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative,HpD)介导的光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)对在体和离体人肺腺癌细胞A549的杀伤作用。方法以MTT法检测HpD-PDT对A549细胞增殖抑制的量效关系,应用流式细胞术分析其对细胞凋亡的影响。进一步构建A549细胞裸鼠移植瘤动物模型,通过绘制肿瘤生长曲线观察HpD-PDT对肺癌生长的抑制作用,并应用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡。结果HpD-PDT作用后,A549细胞增殖受抑,凋亡增加,显著高于对照组(P<0.05),且其抑制效率依赖于HpD浓度及激光剂量;裸鼠移植瘤动物模型肿瘤生长受抑、凋亡增加,也与对照组存在显著性差异(P<0.01)。结论HpD-PDT可有效杀伤肺腺癌细胞,其作用机制可能与抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡有关。     

APE1/Ref-1 siRNA抑制多发性骨髓瘤骨髓基质细胞IL-6及IL-8分泌的体外研究

目的 体外通过APE1/Ref-1 siRNA敲低多发性骨髓瘤骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)APE1/Ref-1的表达,观察BMSCs的增殖及分泌细胞因子IL-6、IL-8的变化,初步探讨BMSCs APE1/Ref-1表达的功能特点.方法 通过免疫细胞化学染色法定量榆测35例初治、11例复发/难治多发性骨髓瘤患者及10例正常人BMSCsAPE1/Ref-1的表达特点及其差异,经Adv5-APE1/Ref-1 siRNA感染BMSCs后,流式细胞仪检测BMSCs细胞周期的变化;ELISA法检测BMSCs分泌IL-6、IL-8的水平变化情况.结果 多发性骨髓瘤BMSCs的APE1/Ref-1蛋白阳性表达率显著高于正常BMSCs APE1/Ref-1蛋白阳性表达率(P<0.05),且多发性骨髓瘤BMSCs的APE1/Ref-1呈细胞核及核浆共间表达方式.Adv5-APE1/Ref-1 siRNA感染敲低多发性骨髓瘤及正常BMSCs APE1/Ref-1的表达量呈进行性减少(P<0.01),同时发现APE1/Ref-1 siRNA对多发性骨髓瘤BMSCs抑制作用更明显.Adv5-APE1/Ref-1 siRNA感染BMSCs后对正常人及骨髓瘤患者BMSCs分泌细胞因子IL-6、IL-8的量有显著的抑制作用,特别是感染72 h后,骨髓瘤患者及正常人的BMSCs分泌IL-6[初治患者(246.29±46.51)pg/ml,复发/难治患者(365.09±75.25)pg/ml]、IL-8[初治患者(118.77±18.08)pg/ml,复发/难治患者(188.71±33.76)pg/ml]的量最低,与其他时段比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 多发性骨髓瘤BMscs APE1/Ref-1的表达特点不同于正常BMSCs,可能导致其功能差异;APE1/Ref-1 siRNA敲低了MM BMSCsAPE1/Ref-1的表达,同时明显抑制了其IL-6、IL-8的分泌,减少了对骨髓瘤细胞的促增殖和凋亡作用.     

APE1/Ref-1表达在小鼠放射性肺损伤形成中的变化特点

目的 观察小鼠放射性肺损伤过程中DNA损伤修复关键酶脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子(apurinic/aprimidinic endonuclease/redox factor-1,APE1/Ref-1)表达的动态变化,初步探讨APE1/Ref-1在放射性肺损伤发生、发展中的作用.方法 雌性昆明小鼠30只,随机分为照射组18只和对照组12只.照射组用8MV直线加速器给予小鼠全胸20Gy单次照射,对照组佯装照射.在照射后1、3、7、14、28、56d共6个时相点,分批活杀小鼠(照射组3只,对照组2只),观察其全肺大体形态改变,取右肺组织,光镜下观察组织形态学变化,免疫组化SP法检测APE1/Ref-1;取左肺组织,Western blot方法检测APE1/Ref-1蛋白表达.结果 正常小鼠肺组织上皮细胞和内皮细胞中APE1/Ref-1呈胞核表达为主,而在小鼠放射性肺损伤不同阶段肺组织上皮细胞和内皮细胞中APE1/Ref-1表达特征有所改变,呈核浆共同表达和胞浆表达为主;并且APE1/Ref-1表达呈现先增高后降低的趋势,照射后1d开始升高,3d达高峰,且明显高于对照组,此后随着小鼠放射性肺损伤发展逐渐降低,28d降至对照组水平,56d明显低于对照组.结论 电离辐射可以刺激APE1/Ref-1蛋白的表达并使其表达发生由核内转向浆内和先增高后降低的特征改变,表明APE1/Ref-1可能在放射性肺损伤修复过程中起着重要作用.     

基于Bayes法的C-12蛋白芯片联合检测判别函数的建立及临床意义分析

目的 结合C-12蛋白芯片检测结果 ,采用Bayes法建立多肿瘤标志物判别函数,以明确肿瘤类型,提高肿瘤诊断准确率;比较多肿瘤标志物判别函数与C-12多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统的差异及对肿瘤诊断的临床意义.方法 用C-12蛋白芯片法检测2 177例恶性肿瘤患者(肺癌836例,肝癌318例,胰腺癌84例,胃癌123例,肠癌338例,乳腺癌206例,卵巢癌47例,子宫内膜癌28例,食管癌197例)和2 111例正常及患良性疾病的非肿瘤患者的12项常见肿瘤标志物,并结合临床资料进行回顾性研究.应用Bayes法建立肿瘤判别诊断函数,比较12种肿瘤标志物和判别诊断函数对肿瘤诊断的准确率差异.结果 成功建立了多肿瘤标志物的三级诊断判别函数.一级判别函数诊断的特异度为82.11%,灵敏度为71.28%,准确率为83.97%,而C-12蛋白芯片法检测12项肿瘤标志物的特异度为70.11%,灵敏度为66.10%,准确率为68.07%.二级判别甬数能显著提高10种常规肿瘤诊断的灵敏度、特异度和准确率.三级诊断判别函数对确定部分肿瘤的类型有意义.结论 基于Bayes法建立的C-12蛋白芯片联合检测判别甬数具有较高的灵敏度、特异度和准确率,对肿瘤的诊断具有重要临床价值.     

siRNA重组腺病毒增强贝伐单抗对移植骨肉瘤的治疗作用

目的：探讨以DNA损伤修复基因脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶基因（apurinic/aprimidinic endonuclease1,APE1）为靶点的siRNA在骨肉瘤治疗中的作用及其与贝伐单抗（bevacizumab,Avastin）的协同效应。方法：建立人骨肉瘤9901细胞荷瘤裸鼠模型,16只荷瘤鼠随机分为4组：EGFP对照组,APE1 siRNA治疗组,Avastin治疗组和联合治疗组（Avastin+APE1 siRNA）。观察移植瘤生长情况并计算抑瘤率,免疫组织化学法检测肿瘤组织微血管密度和Ki67表达,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡,激光共聚焦检测肿瘤组织的缺氧状态,Western blotting检测肿瘤组织内VEGF蛋白的表达。结果：与APE1 siRNA治疗组和Avastin治疗组相比,Avastin+APE1 siRNA治疗组的抑瘤率显著增加（P<0.01）。各治疗组的微血管密度及Ki67表达明显低于对照组,且Avastin+APE1 siRNA治疗组微血管密度和Ki67表达显著低于单独治疗组（P<0.01）。各治疗组的凋亡指数明显高于对照组,且Avastin+APE1 siRNA治疗组明显高于单独治疗组（P<0.01）。APE1siRNA或Avastin治疗均可引起肿瘤组织缺氧,抑制肿瘤组织中VEGF的表达,Avastin+APE1 siRNA治疗效果更加明显。结论：以APE1为靶点的siRNA能显著抑制裸鼠移植骨肉瘤的血管生成和瘤体生长,并诱导肿瘤细胞凋亡,且与Avastin具有协同作用。