丙戊酸钠下调SH-SY5Y细胞中Bcl-2表达的作用及机制分析

目的 探讨丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)在神经细胞中下调Bcl-2表达的作用及可能机制.方法 用不同浓度的VPA处理SH-SY5Y细胞,定量PCR检测Bcl-2 mRNA与miR-34a水平变化,Western blot检测Bcl-2蛋白水平变化,报告基因系统检测Bcl-2启动子活性变化,联合转录抑制剂处理细胞,分析Bcl-2 mRNA稳定性变化,联合miR-34a模拟物及抑制剂处理细胞,进一步分析miR-34a在VPA下调Bcl-2表达中的作用.Annexin V/PI双染结合流式分析细胞凋亡情况.结果 VPA可浓度依赖性下调SH-SY5Y细胞中Bcl-2的mRNA与蛋白水平(P＜0.05).VPA暴露不改变Bcl-2的启动子活性(P＞0.05),但显著降低了其mRNA的稳定性(P＜0.05).同时,VPA可上调SH-SY5Y细胞中miR-34a的表达(P＜0.05),联合使用miR-34a的抑制剂可逆转VPA对Bcl-2表达的下调作用,且单独的miR-34a模拟物也可以下调细胞中Bcl-2的表达.VPA暴露还可引起SH-SY5Y细胞的凋亡增加(P＜0.05).结论 VPA可通过上调SH-SY5Y细胞中miR-34a水平而抑制Bcl-2的表达.     

认识和预防亚健康状态

随着人们生活水平的提高,生活质量和健康要求越来越受到关注和追求。因此亚健康问题成为很多人的苦恼和困扰。     

丙戊酸钠通过激活miR-34c-5p/ATG4B信号通路抑制SH-SY5Y细胞自噬

目的探讨丙戊酸钠（VPA）对SH-SY5Y细胞中miR-34c-5p/ATG4B信号通路的激活作用及对自噬的影响。方法人神经 母细胞瘤细胞SH-SY5Y用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养,然后使用不同剂量VPA处理SH-SY5Y细胞24 h,采用 定量PCR分析VPA处理对ATG4B mRNA与miR-34c-5p表达的影响,免疫印迹法分析VPA处理对ATG4B蛋白表达的影响,将 含ATG4B启动子片段的报告质粒转染SH-SY5Y细胞,然后通过荧光素酶报告基因系统分析VPA处理对ATG4B启动子活性的 影响,用VPA单独或联合转录抑制剂放线菌素D分别处理SH-SY5Y细胞不同时间,定量PCR分析检测不同处理对ATG4B mRNA稳定性的影响,用VPA单独或联合miR-34c-5p抑制剂处理细胞24 h,通过检测不同处理对ATG4B表达变化的影响,进 而判断miR-34c-5p在VPA下调ATG4B表达中的作用,同时通过Western blot检测不同处理对LC3-II表达的影响,分析细胞自 噬水平变化。结果VPA可剂量依赖性降低SH-SY5Y细胞中ATG4B的mRNA和蛋白水平（P<0.05）。VPA处理不影响SHSY5Y 细胞中ATG4B的启动子活性（P>0.05）,但显著下调其mRNA的稳定性（P<0.05）。同时,VPA处理明显增强SH-SY5Y细 胞中miR-34c-5p的表达水平（P<0.05）。使用miR-34c-5p抑制剂与VPA联合处理SH-SY5Y细胞,可逆转VPA对ATG4B表达的 下调作用。VPA处理还下调了SH-SY5Y细胞中LC3-II的表达水平（P<0.05）。结论VPA可能通过激活miR-34c-5p/ATG4B信 号通路而抑制SH-SY5Y细胞自噬。     

微量元素与儿童的脑发育

为了保证儿童脑的良好发育与发展,应该重视孕母及儿童微量元素的合理供给.本文主要对一些重要微量元素对儿童脑发育的影响作用进行了研究综述,旨在帮助人们理解微量元素与儿童脑发育的关系.     

hLNα4LG1基因克隆、表达及生物学活性检测

目的克隆并表达具有生物学活性的人层黏连蛋白α4链LG1组件(human laminin alpha4 chain LG1 module,hLNα4LG1)蛋白.方法RT-PCR扩增hLNα4LG1的cDNA片段并将其插入pMD-18T载体进行测序.将测序片段亚克隆入原核表达载体pET-28a并在BL21(DE3)大肠杆菌中进行表达,Western blot对表达蛋白进行鉴定.用Ni-NTA亲和柱对目的蛋白进行纯化,并通过细胞黏附与伸展实验对其生物学活性进行检测.结果成功克隆了hLNα4LG1的cDNA片段,SDS-PAGE及Western blot分析显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET28a-LG1总蛋白中出现一条分子量为26×103的新蛋白带.与对照组相比,Ni-NTA亲和层析纯化的目的蛋白有明显促进A549细胞伸展与黏附的作用.结论克隆并原核表达了hLNα4LG1蛋白,目的蛋白具有促进细胞黏附与伸展的活性,为深入研究hLNα4LG1的功能奠定了基础.     

人层粘连蛋白α4链LG3-4组件的克隆和表达

目的利用基因工程技术获得重组人层粘连蛋白α4链LG3-4组件(human laminin Alpha4 LG3-4 Module, hLNα4LG3-4)蛋白并检测其抗原性.方法采用RT-PCR方法从人胎盘组织扩增hLNα4LG3-4的cDNA片段,T/A克隆法将其插入pMD-18T载体进行测序.亚克隆法构建原核表达载体pET-28a-LG3-4,在BL21(DE3)中表达hLNα4LG3-4融合蛋白.融合蛋白经SDS-PAGE鉴定、Ni-NTA亲和层析纯化及Western印迹分析.结果成功获得hLNα4LG3-4 cDNA片段,与GenBank中序列同源性为98%,突变碱基不改变蛋白的氨基酸序列.12%SDS-PAGE电泳检测显示:经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET28a-LG3-4细菌裂解液总蛋白中出现一条分子量为44×103的新蛋白带,纯化后目的蛋白纯度达95%以上,且Western印迹可特异地检测到目的蛋白所对应转移带.结论成功表达和纯化了hLNα4LG3-4蛋白,从而为研究LG组件在疾病发生过程中的作用及其功能位点打下了基础.     

层黏连蛋白α4链中αvβ3整合素结合肽的精细鉴定与功能分析

目的 利用点突变、缺失突变及功能实验确定αvβ3整合素在已鉴定人层黏连蛋白α4链(human laminin alpha4,LNα4)G19肽段中的最小结合位点及关键氨基酸残基.方法 采用同源序列比较确定G19肽中的保守氨基酸残基,点突变确定其中的关键氨基酸残基,缺失突变确定αvβ3整合素结合的最小肽段,并通过人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)管样结构形成实验及鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)实验验证鉴定肽的生物学功能.结果 同源性比较分析发现,G19肽中共存在10个保守性氨基酸残基位点.点突变分析发现第4位的I、第10位的H及第16位的Y是αvβ3整合素结合的关键位点,缺失突变分析确定G1124-1137肽段(G14肽)是αvβ3整合素结合的最小肽段, 合成的G14肽可以浓度依赖性地促进HUVEC管样结构的形成及CAM的血管生成.结论 成功鉴定了αvβ3整合素在LNα4中的最小结合位点及关键氨基酸残基.所鉴定的肽段具有促HUVEC成管样结构及促CAM血管生成的生物学功能.     

自闭症儿童的婴幼儿喂养状况调查研究

本研究通过“婴幼儿喂养史调查表”对重庆市60名自闭症儿童及70名正常儿童的婴幼儿喂养史进行了对照调查研究，结果表明：自闭症儿童母乳喂养及持续母乳喂养时间超过6个月的人数比例明显低于正常儿童；婴幼儿期，自闭症儿童较正常儿童更多喜欢吃豆制品和更多具有异食癖现象，自闭症儿童婴幼儿期的总体营养状况与正常儿童可能无明显差异。     

人层粘连蛋白α4链LG4-5组件的原核表达及多克隆抗体制备

目的利用基因工程技术克隆、表达人层粘连蛋白α4链LG4-5组件(human laminin alpha4 LG4-5 module,hLNα4LG4-5)蛋白并制备其特异性多克隆抗体.方法采用RT-PCR方法从人胎盘组织扩增hLNα4LG4-5的cDNA片段,T/A克隆法将其插入pMD-18T载体进行测序.采用DNA重组技术构建原核表达载体pET-28a-LG4-5,用BL21(DE3)/pET系统表达hLNα4LG4-5融合蛋白,以SDS-PAGE鉴定所表达的融合蛋白.用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备抗hLNα4LG4-5多克隆抗体,Western印迹法检测抗体的特异性.结果成功克隆了hLNα4LG4-5的cDNA片段,12%SDS-PAGE电泳检测显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET28a-LG4-5总蛋白中出现一条分子质量为42×103的新蛋白带,制备了效价为1:10 240的hLNα4LG4-5多克隆抗体,Western印迹分析证实可检测到特异性目的蛋白带.结论克隆并原核表达了hLNα4LG4-5蛋白,制备了特异性抗hLNα4LG4-5的多克隆抗体,为进一步研究LG组件在疾病发生中所起的作用打下了基础.     

人67 LR噬菌体结合肽的筛选与功能分析

目的 为了获得能够与人67 ku层黏连蛋白受体(67 ku laminin receptor,67 LR)特异性结合的噬菌体呈现肽.方法 以重组人67LR蛋白为诱饵,分别对噬菌体12肽库和环7肽库进行亲和凝胶筛选,ELISA测定所筛选噬菌体克隆与靶蛋白的亲和力,经测序分析得到67 LR特异性结合噬菌体克隆,并通过293细胞侵袭转移实验测定阳性噬菌体呈现肽对67LR促细胞侵袭作用的抑制效果.结果 经4轮筛选共筛到2类新的67LR结合肽,分别具有DXCETCT(X可变)和YRPMXEY(X可变)一致序列.其中DX-CETCT噬菌体呈现肽可显著抑制67 LR所诱导的细胞侵袭,且这种抑制作用与YIGSR 5肽具有一定互补性.结论 成功筛选到2类新的67 LR结合肽,其中DXCETCT噬菌体呈现肽可针对性抑制67LR所诱导的细胞侵袭作用.