双重实时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌

目的建立改良分子信标双重实时PCR同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌的快速方法,应用于霍乱监测、副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)和副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,分别设计引物和改良分子信标探针,以10种细菌作对照,建立双重实时PCR改良分子信标检测体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和霍乱监测。结果改良分子信标双重实时PCR反应体系DNA灵敏度为102.4～166.6fgμl,菌液灵敏度为32～64CFUml或3～6CFUPCR反应体系,无交叉反应。此反应体系同时检测40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时PCR阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性。从样品处理到检测结果仅需1天时间。结论改良分子信标双重实时PCR检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱和副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

改良分子信标—实时PCR快速检测副溶血弧菌

目的 :建立改良分子信标 -实时 PCR检测副溶血弧菌的快速方法 ,应用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法 :根据 Gen Bank公布副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因 (TDH)的保守序列 ,设计一对引物和改良分子信标探针 ,用 FAM荧光剂标记探针的 5′,并进行特异性和灵敏度分析 ;同时以 11种细菌作对照 ,建立改良分子信标检测副溶血弧菌的实时 PCR反应体系 ,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和食品微生物检测。结果 :检测 12种细菌 ,只有副溶血弧菌有荧光信号 ,与其他细菌无交叉反应 ,DNA灵敏度为 16 6 .6 fg/ μl,菌液灵敏度为 6 9cfu/ ml或 6 cfu/ PCR反应体系。改良分子信标 -实时 PCR反应体系检测 4 0株副溶血弧菌均出现特异的荧光信号 ,无干扰。对 3起细菌性食物中毒共 4 8份样品和 10 0份海产品进行检测 ,9份副溶血弧菌实时 PCR阳性 ,其中 7份副溶血弧菌细菌培养阳性 ,其余样品都为阴性。检测时间仅需 2 h。结论 :改良分子信标 -实时 PCR检测体系快速、灵敏度高 ,特异性强 ,可用于副溶血弧菌食物中毒的快速诊断 ,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段     

多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌

目的 建立改良分子信标，多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因，分别设计一对引物和改良分子信标探针，用同色荧光标记，用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，加入沙门菌检测体系中，建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系，应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl。菌液灵敏度为32～64CFU／ml或1～2CFu／PCR反应体系，无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌，均出现特异的荧光信号，两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测，569份沙门菌实时PCR阳性，其中551份沙门菌培养阳性；42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断，伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

改良分子信标-实时PCR快速检测产单核李斯特菌

目的：建立改良分子信标-实时PCR检测产单核李斯特菌（LMO）的快速方法，应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。方法：根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，建立改良分子信标-实时PCR检测体系，应用于食品中LMO检测。结果：改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110fg，菌液灵敏度为99cfu／ml或4cfu／PCR反应体系，无交叉反应。以此反应体系检测28株LMO，均出现特异的荧光信号。上述方法可将检测时问由原来的至少4d缩短至1d。对228份食品进行LMO检测，8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性，其中6份1310细菌培养阳性。结论：改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高，特异性强．能提高LMO的检出率和准确性，可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断。     

深圳市食物中毒来源金黄色葡萄球菌的分子流行病学分析

目的建立金黄色葡萄球菌(金葡菌)的分子分型技术,研究深圳市食物中毒来源金葡菌的分子流行病学特征。方法对食物中毒事件中食物链的不同环节均采集标本,进行金葡菌分离培养。对所分离菌株同时应用SPA分型及PFGE技术作分子流行病学分析。结果 136起疑似食物中毒事件中有12起能够从食物链不同环节分离到金葡菌,共59株。PFGE将59株金葡菌分为15个型别,在10起食物中毒事件的不同环节中分析到PFGE型别一致的菌株,分辨系数为0.87。SPA分型将59株金葡菌分为10个型别,在12起食物中毒事件中不同环节样品中分析到SPA型别一致的菌株,分辨系数为0.85。结论 PFGE的分辨力高于SPA分型;通过结合流行病学资料分析,12起食物中毒事件中有6起能够通过分子分型方法准确溯源。     

益气活血法对舒张性心力衰竭大鼠心肌细胞钙稳态的影响

目的 研究不同比例益气活血药对舒张性心力衰竭(DHF)大鼠的疗效,探讨其对心肌细胞钙稳态的影响机制.方法 采用改良缩窄腹主动脉术制备压力负荷致DHF大鼠模型.将大鼠分为假手术组、模型组、益气组(黄芪3 g、党参1.5 g)、益气活血1:1组(黄芪3 g、党参1.5 g、丹参3g、三七1g)、益气活血2:1组(黄芪6g、党参3g、丹参3g、三七1g),每组20只,连续干预12周.治疗4、12周进行心功能检测,测量舒张期左室前壁厚度、舒张期左室后壁厚度、舒张期左室内径、左室射血分数和左室短轴缩短率及舒张早期跨二尖瓣血流速度(E)与舒张早期二尖瓣环运动幅度(e)比值(E/e);12周进行血流动力学检测,分别在静息状态和盐酸多巴胺负荷状态下记录左室压力下降速率、左室舒张末期压力(LVEDP)以评价左室舒张功能,记录左室压力上升速率,左室收缩压力(LVESP)以评价左室收缩功能,并记录心率及颈动脉压力;12周后处死大鼠,检测心肌细胞舒缩功能及钙转运情况,测量心肌细胞的收缩速率、舒张速率、收缩50％时间(CT50)和舒张50％时间(RT50);测定钙释放速率、钙回摄速率、钙释放50％时间(CaT50-on)和钙回摄50％时间(CaT50-off),分析钙瞬态数据;Western blot法检测钙转运相关蛋白钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、蛋白激酶A(PKA)、16-丝氨酸位点磷酸化受磷蛋白(PLBS16)、17-苏氨酸位点磷酸化受磷蛋白(PLBT17)表达水平.结果 干预12周后,全部治疗组均改善大鼠舒缩功能LVEDP、RT50、CT50,益气活血2:1组改善舒张早期二尖瓣血流速度E峰/舒张早期二尖瓣环纵向运动速率e峰(E/e)比值、多巴胺负荷下LVEDP和逆转心室重构(降低左室前壁和后壁厚度).在细胞水平,全部治疗组均缩短心肌细胞CT50、RT50、CaT50-on和降低CaMKⅡ表达,两组益气活血治疗组还可降低PKA过表达,益气活血2:1组可降低CaT50-off和改善PLBS16低磷酸化.结论 益气和活血药物以2:1比例配伍比1:1配伍治疗DHF具有更好的疗效,其作用机制可能与调节钙转运有关.     

荧光PCR和PFGE在副溶血弧菌食物中毒诊断中的应用研究

[目的]探讨荧光PCR和脉冲场电泳（PFGE）在副溶血弧菌食物中毒调查中的应用。[方法]对中毒样品进行荧光PCR检测,副溶血弧菌临床分离株基因组DNA经NotI酶切,通过PFGE获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。[结果]部分样品荧光PCR检测结果呈阳性,同起食物中毒菌株PFGE图谱一致。[结论]荧光PCR可以快速准确的鉴定病原体。PFGE具有很强的菌株同源性分析能力,适用于食物中毒病原菌学鉴定和传染源溯源。荧光PCR和PFGE在食物中毒的快速诊断中可发挥重要作用。     

脉冲场凝胶电泳在沙门菌食物中毒溯源中的应用研究

目的用脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法,追踪某次沙门菌食物中毒的来源,确定中毒食品,快速控制传染源。方法对食物中毒中分离的肠炎沙门菌用XbaI酶切总DNA,用脉冲场凝胶电泳（PFGE）法进行分子分型,用BioNumerics软件对PFGE分型图谱进行电子化数据分析,绘出聚类分析图。结果脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型方法对患者样本分离的242株肠炎沙门菌进行分子分型,型别基本一致,表明是同一批食物中毒;从三文治等蛋糕制品中分离的9株菌株与患者分离株图谱完全一致,表明此次食物中毒的源头为某蛋糕厂生产的三文治等食品。结论脉冲场凝胶电泳技术适用于菌株的同源性的分析和传染源的追踪。     

深圳市伤寒PulseNet数据库的初步建立与应用

[目的]建立深圳市伤寒PulseNet数据库,用于伤寒的实时监测和分子流行病学调查。[方法]采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术,对深圳市2002～2005年106株伤寒的染色体DNA进行酶切,用BioNumerics软件对PFGE分型图谱电子化数据分析,建立分子分型数据库。[结果]深圳市各年的伤寒菌株变异较多,呈现30多种PFGE图谱。同一起伤寒暴发的临床分离株具有相同的PFGE图谱。[结论]深圳市伤寒PulseNet数据库的初步建立,对直观地分析各起疫情之间的相互关系,对疫情的控制和传染来源的追踪具有重要意义。