HMGN2对大肠埃希氏菌TA系统的作用

目的研究HMGN2对大肠埃希氏菌TA系统作用。方法用5％高氯酸萃取兔胸腺组织,通过反相高效液相色谱进一步分离纯化蛋白,用Tricine-SDS-PAGE、AU-PAGE和Dot-blot进行鉴定。采用凝胶迁移阻滞试验（EMSA）检测HMGN2对大肠埃希氏菌TA系统的结合作用;平板菌落记数法检测TA系统激活或非激活条件下,菌体过表达重组HMGN2和对照组对细菌存活百分率的影响。结果HMGN2可阻滞mazEF基因的泳动速率,且随HMGN2浓度增加,阻滞作用增强。利福平激活TA系统,菌体过表达重组HMGN2后,与对照组比较细菌存活量减少约30％,有统计学差异。而头孢哌酮不能激活TA系统,过表达重组HMGN2组和空质粒组CFU％分别为70．2％、68．9％,两者无明显差异。结论HMGN2可加强mazEF系统介导的细菌程序性死亡;HMGN2对TA系统的作用也可能是其抗大肠埃希氏菌作用的机制之一。     

酵母双杂交筛选胎肾上腺cDNA文库中HNP-1结合蛋白

[目的]筛选胎肾上腺cDNA文库中与α防御素HNP-1成熟肽具有相互作用的蛋白分子。[方法]通过聚合酶链反应(PCR)成功获得HNP-1成熟肽基因插入酵母表达载体pGBK-T7中构建诱饵质粒,同时提取胎肾上腺RNA,SMART技术制备人胎肾上腺cDNA文库,并采用Matchmaker LexA酵母双杂交系统从胎肾上腺cDNA文库中筛选与HNP-1成熟肽相互作用的蛋白。最后通过PCR筛选获得阳性克隆并测序,而后经回转实验,GST pull down以及免疫共沉淀再次验证两者的相互作用关系。[结果]成功构建诱饵质粒pGBKT7-HNP-1以及胎肾上腺cDNA文库并在酵母细胞中正确表达,筛选获得HNP-1成熟肽相互作用的蛋白-melanocortin 2 receptor (ACTH-R),CCAAT-enhancer-bind-ing proteins(C/EBP),Tramembrane trafficking protein(TMP21),low density lipoprotein receptor-related protein 6(LRP6)。最终选定促肾上腺皮质激素受体(ACTH-R)作为主要研究对象,且经GST pull down以及免疫共沉淀实验获得了证实两者间具有相互作用的相应的条带。[结论]从胎肾上腺cDNA文库中成功筛选得到α防御素HNP-1成熟肽相互作用蛋白——促肾上腺皮质激素受体。     

兔胸腺HMGN2的分离纯化鉴定

目的：分离纯化鉴定兔高迁移率非组蛋白N2（High mobility group chromosomal proteinN2，HMGN2）。方法：利用液氮研磨和5％高氯酸从新鲜兔胸腺组织获得酸溶性萃取物，经反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离得到HMGN2，经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blotting对HMGN2进行分子量测定和特异性鉴定。并利用琼脂糖弥散抑菌实验对其杀菌活性进行鉴定。结果：利用上述方法分离纯化出高纯度的兔HMGN2。对大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌ATCC25922有明显杀菌活性。结论：建立简单分离高纯度的HMGN2的方法。     

HMGN2基因干扰质粒构建及干扰效率测定

目的：构建HMGN2基因的干扰质粒,为深入研究HMGN2基因在信号通路中的作用提供有效手段。方法：根据文献选择两个HMGN2基因的干扰位点,合成两个干扰片段定向克隆到psilencer-4．1的干扰载体并测序验证。将干扰质粒转染至A549细胞,并通过检测RT-PCR产物量以获得干扰效率。结果：RT—PCR产物检测结果显示干扰质粒psilencer-4．1-HMGN2—2干扰效率最高,其HMGN2表达量降低了70％左右。结论：成功构建了对HMGN2基因具有显著干扰效率的psilencer-4．1-HMGN2干扰质粒,为进一步研究HMGN2基因的功能打下了基础。     

HNP-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

目的筛选胎肾上腺cDNA文库中与人中性粒细胞多肽(HNP-3)成熟肽具有相互作用的蛋白分子。方法通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功获得HNP-3成熟肽基因,并将其插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转染酵母细胞AH109,而后经缺陷性培养基上培养并观察pGBKT7-HNP-3在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能。同时收集胎肾上腺,提取RNA,通过自我检测、分析、报告技术(SMART技术)制备人胎肾上腺cDNA文库。并采用Match-maker LexA酵母双杂交系统从胎肾上腺cDNA文库中筛选与HNP-3成熟肽相互作用的蛋白。最后通过PCR筛选获得阳性克隆并测序,通过回转实验,谷胱甘肽巯基转移酶沉降技术(GST pull down)以及免疫共沉淀实验再次验证二者的相互作用关系。结果成功构建诱饵质粒pGBK-T7-HNP-3以及胎肾上腺cDNA文库并在酵母细胞中正确表达,筛选获得HNP-3成熟肽相互作用的蛋白——促肾上腺皮质激素受体(ACTH-R)2、钙粘着蛋白关联蛋白1(CTNNB1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)、成对样同源域转录因子2(PITX2)等。最终选定ACTH-R作为主要研究对象,且经GST pull down以及免疫共沉淀实验获得了证实二者间具有相互作用的相应的条带。结论从胎肾上腺cDNA文库中成功筛选得到α防御素HNP-3成熟肽相互作用蛋白——ACTH-R。     

小鼠胚胎神经系统发育过程中mBD-4的表达

目的观察β-防御素4（mouseβdefensin 4,mBD-4）在小鼠胚胎神经系统发育不同时期的基因表达及脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导孕鼠后mBD-4在胚鼠神经系统的的表达情况。方法孕鼠分为LPS组（n=10）和正常对照组（n=10）,取不同时期（5.5、8.5、11.5、17.5天）小鼠胚胎,LPS组于胚胎提取1天前母鼠腹腔注射LPS,正常对照组同时间注射同量的生理盐水,胚胎取出后石蜡包埋切片,免疫组化方法和RT-PCR技术检测mBD-4的阳性表达。结果 mBD-4在小鼠胚胎早期第5.5天的神经组织中未见固有表达,到胚胎第8.5天开始有少量固有表达,到胚胎中晚期,固有表达含量增多;LPS组中胚胎神经组织中自5.5天有阳性表达,且随着胚胎的发育其阳性表达越强。结论①mBD-4在小鼠胚胎神经系统中固有表达,在胚胎第8.5天有少量表达,且随着神经系统的发育成熟,mBD-4在其神经组织中表达含量越多。③mBD-4在LPS的诱导下,其在神经组织中表达明显增高。     

胚胎及生后不同发育时期小鼠肺β-防御素1的表达

目的研究小鼠在胚胎及生后发育不同阶段肺β-防御素1（mBD-1）的表达。方法孕鼠随机分成2组：对照组和实验组。实验组于胚胎提取及出生前24h腹腔注射LPS,对照组以等剂量生理盐水代替。各组分别于14.5、17.5 dpc（days post coition,交配后天数）、生后0d、生后4d取肺组织进行石蜡包埋、连续切片,并进行mBD-1的免疫组化染色,用图像分析系统进行定量分析,并进行统计学处理。结果对照小鼠从14.5d胚胎至出生后4 d各时期肺组织中均存在mBD-1阳性表达,且呈增加趋势（P〈0.05）;而同一时间点实验组阳性表达略高于对照组,但与对照组相比差异无统计学意义（P〉0.05）。结论本实验表明不同发育阶段小鼠肺组织均表达mBD-1,且其表达呈上升趋势,提示该分子可能是肺组织天然抵抗微生物感染的一个重要分子基础。     

胡椒碱-阿霉素复合物合成及抗肿瘤研究

目的合成胡椒碱-阿霉素复合物,并探讨其抗肿瘤活性。方法将胡椒碱-阿霉素复合物制备成纳米混悬体冻干制剂,体外培养肿瘤细胞,用MTT法考察胡椒碱-阿霉素复合物纳米混悬液冻干制剂对HEPG-2细胞株、SMMC-7721/ADM细胞株、MCF-7/ADM细胞株、A549细胞株、B16细胞株、Hela细胞株、K562细胞株的抑制作用,并绘制抑制率-药物浓度曲线。结果对7种肿瘤细胞均有抑制作用,且抑制作用比阿霉素组更强。结论胡椒碱-阿霉素复合物对HEPG-2细胞株、SMMC-7721/ADM细胞株、MCF-7/ADM细胞株、A549细胞株、B16细胞株、Hela细胞株和K562细胞株生长有抑制作用,且抑制效果好于阿霉素。     

HMGN2对大肠埃希氏菌黏附Hela细胞的影响

目的探讨HMGN2对大肠埃希氏菌黏附Hela细胞的影响。方法采用Hela细胞模型,光镜以及扫描电镜观察大肠埃希氏菌ATCC25922黏附Hela细胞模型的建立。用以下三组不同方式,观察梯度抑菌浓度下（分别为5、10、15μg／ml）HMGN2对细菌黏附的影响。黏附抑制组：HMGN2、细菌、细胞共同孵育1小时;干扰模型组：细菌、细胞孵育1小时后,PBS洗去未黏附细菌,再加入HMGN2孵育2小时;细菌预处理组：HMGN2、细菌孵育2小时,离心洗去HMGN2,收集细菌,所得细菌再与细胞孵育1小时。用平板菌落计数法观测细胞内、外活茼数,并计算黏附指数以及黏附抑制率。结果光镜及扫描电镜可见细菌黏附于细胞表面,黏附模型构建成功。三组的结果均提示：在HMGN2梯度抑菌浓度下,细菌的黏附指数随着HMGN2的浓度的升高而减小;黏附抑制率则随着其浓度的升高而逐渐增大（P〈0．05）。结论抑菌浓度下的HMGN2：对大肠埃希氏菌ATCC25922黏附Hela细胞有明显的抑制作用;可减低已经黏附于细胞表面的细菌的黏附能力;可能直接作用于细菌,导致其黏附能力降低。