SARS冠状病毒棘突蛋白的S1蛋白诱导小鼠产生中和抗体的研究

目的 研究SARS冠状病毒棘突蛋白受体结合部位S1的免疫原性，为SARS的实验诊断和新型疫苗的研究提供依据。方法 用克隆有哺乳动物细胞密码子优化的SARS-CoV S1基因的质粒pcDNA3．1／S1或P-S1Ig转染293T细胞，用细胞的上清液纯化S1蛋白。以pcDNA3．1／S1质粒对BALB／c小鼠进行2次基因免疫，以纯化的S1蛋白进行加强免疫。用ELISA法检测小鼠抗SARS-CoV的特异性IgG抗体，并在Vero E6细胞上做体外中和实验，检测中和抗体。结果 S1蛋白诱导小鼠产生抗SARS-CoV的特异性抗体；1：1499．68稀释的S1蛋白免疫的小鼠血清可保护50％的细胞对1000TCID50的病毒攻击，而阴性对照血清不能保护细胞对病毒的感染。结论 SAPS冠状病毒棘突蛋白受体结合部位S1能有效诱导机体产生具有高效保护作用的中和抗体免疫反应，可望发展成为理想的SARS棘突蛋白亚单位疫苗。     

禽流感病毒非结构蛋白1单克隆抗体的制备及其特异性分析

为研制禽流感病毒(H5N1)非结构蛋白1(NS1)的特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性,本研究在分别表达了具有良好抗原性的A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1和A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1重组蛋白基础上,用A/Viet-nam/1194/04(H5N1)-NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光和免疫印迹对抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制实验对单抗识别的抗原位点进行分析。结果共获得19株能识别4个H5N1-NS1蛋白不同抗原位点的mAb,亚类测定显示,5株为IgG2a、1株为IgG2b,另外13株为IgG1。这些mAb均与A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1和A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1重组蛋白特异性结合,免疫荧光检测均与A型流感病毒(H1N1和H3N2)有交叉反应,而与B型流感病毒无交叉现象。表明成功获得特异性针对H5N1-NS1蛋白的mAb,为进一步研究禽流感病毒NS1蛋白的结构与功能奠定基础。     

B型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法的建立和临床应用2

目的 制备和鉴定B型流感病毒核衣壳（N）蛋白单克隆抗体（mAb）,建立双抗体夹心捕获抗原ELISA,用于B型流感病毒感染的早期诊断。方法 用重组B型流感病毒N蛋白和B型流感病毒抗原免疫BALB/c小鼠制备mAb,采用ELISA间接法、免疫荧光（IFA）和免疫印迹（WB）进行筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验建立双抗体夹心捕获抗原ELISA法检测B型流感病毒 N抗原。结果 获得12株特异性针对B型流感病毒 N蛋白的mAb,识别8个不同的抗原位点,根据mAb识别抗原表位,对mAb进行多种组合的配对试验,筛选出2株单抗BN4和BN8混合作为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记的单抗BN1 和BN5混合作为测定抗体,建立了双抗体夹心ELISA法,测定新鲜的漱口液标本的灵敏度达100％,而对冻融的漱口液标本检测灵敏度为83.9％,与其他呼吸道病毒如A型流感病毒、副流感病毒等无交叉反应,特异度达100％。结论 获得特异性好的mAb,经过抗体的配对和优化,建立了一种灵敏度高、特异性强的B型流感病毒抗原的ELISA捕捉法,可用于B型流感病毒感染的早期实验室诊断及流行病学研究。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的 在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上，制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法 原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段Slc(N端249-667氨基酸残基)，其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB／c小鼠，按常规方法制备单克隆抗体，并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果 筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株，IgG亚类鉴定1株为IgG1，2株为IgG2a，经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论 获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体。为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p抗体

目的建立一种检测马尔尼菲青霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。方法利用毕赤酵母系统表达重组马尔尼菲青
霉特异性甘露糖蛋白Mp1p,并利用改良过碘酸钠法标记Mp1p,经棋盘滴定法建立一种可检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体
的双抗原夹心ELISA法,并检测100例健康人群对照血清、21例血培养确诊其他真菌感染病人血清和15例血培养确诊马尔尼
菲青霉病人血清,联合本实验室前期建立的马尔尼菲青霉抗原检测方法评价其临床应用价值。结果成功建立一种检测马尔
尼菲青霉Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,经健康人群对照及其他真菌感染病人血清评价特异度为100%（121/121）,
检测15例马尔尼菲青霉病人血清,Mp1p特异性抗体2例阳性,Mp1p特异性抗原12例阳性,Mp1p抗体与抗原联合检测可明显
提高灵敏度,达到93.3%（14/15）。结论双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体具有高度的特异性,联合抗
原检测可提高马尔尼菲青霉感染诊断率。
     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上,制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段S1c(N端249-667氨基酸残基),其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定1株为IgG1,2株为IgG2a,经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体,为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA的建立

目的 建立基于单克隆抗体的甲型流感病毒非结构蛋白1(NS1)抗原检测的酶联免疫吸附(ELISA)法.方法 用甲型流感病毒NS1特异性单克隆抗体,通过抗体的优化组合,建立双抗体夹心抗原捕获ELISA,检测不同来源的流感病毒及副流感病毒.结果 对多种抗体组合进行反复筛选,最终确定了特异性检测到甲型流感病毒的NS1蛋白,而与乙型流感病毒和副流感病毒不发生交叉反应的最佳抗体组合.该方法 检测重组H5N1-NS1[A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1和A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1]蛋白的灵敏度最低检测值分别为15.6 ng/ml和240 pg/ml.结论 成功建立了甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA,为建立甲型流感病毒感染早期诊断新方法 奠定基础.     

A型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法的建立和临床应用

[摘要] 目的 制备和鉴定A型流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体,建立A型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法,用于A型流感病毒感染的实验室早期诊断。方 法 利用杆状病毒系统表达A型流感病毒核衣壳蛋白,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定,用双抗体夹心ELISA捕获法建立检测A型流感病毒核衣壳蛋白的方法。 结果 获得8株、共识别4个A型流感病毒核衣壳蛋白不同抗原位点的单克隆抗体,选择以单抗2B8A11作为捕获抗体,以C16A15作为检测抗体为最佳抗体对,建立双抗体夹心ELISA捕获法。检测流感患者的当日采集和冻存的呼吸道标本,与病毒分离培养方法的符合率分别为100%和42.9%;与B型流感病毒和其他呼吸道病毒无交叉反应。检测流感患者当日采集的呼吸道标本敏感性高于德国Serion试剂盒（P＜0.001）,与RT-PCR方法比较差异无显著性（P=0.5）。结论 成功建立了灵敏度高、特异性强的A型流感病毒核衣壳蛋白抗原的ELISA捕获法,为A型流感病毒感染的实验室早期诊断提供技术方法。     

甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA的建立

目的 建立基于单克隆抗体的甲型流感病毒非结构蛋白1(NS1)抗原检测的酶联免疫吸附(ELISA)法.方法 用甲型流感病毒NS1特异性单克隆抗体,通过抗体的优化组合,建立双抗体夹心抗原捕获ELISA,检测不同来源的流感病毒及副流感病毒.结果 对多种抗体组合进行反复筛选,最终确定了特异性检测到甲型流感病毒的NS1蛋白,而与乙型流感病毒和副流感病毒不发生交叉反应的最佳抗体组合.该方法 检测重组H5N1-NS1[A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1和A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1]蛋白的灵敏度最低检测值分别为15.6 ng/ml和240 pg/ml.结论 成功建立了甲型流感病毒NS1抗原捕获ELISA,为建立甲型流感病毒感染早期诊断新方法 奠定基础.     

抗马尔尼菲青霉单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备和鉴定抗马尔尼菲青霉单克隆抗体(mAb)。方法用基因重组马尔尼菲青霉甘露糖蛋白1(MP1)抗原免疫BALB/c小鼠,制备mAb,并采用ELISA间接法和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出4株稳定分泌抗马尔尼菲青霉mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定均为IgG1,抗体亲和常数分别为8.2×10-9、4.7×10-9、6.5×10-9和2.7×10-9,免疫印迹证实马尔尼菲青霉mAb特异性识别MP1。结论4个杂交瘤细胞株特异性好、亲和力高,为马尔尼菲青霉病的快速诊断奠定了基础。