大鼠成体心肌细胞的分离和培养

目的: 探索稳定的大鼠成体心肌细胞的分离和培养方法. 方法: 应用主动脉逆行生物酶(5 g/L胰蛋白酶及1 g/L胶原酶)灌流法分离大鼠成体心肌细胞,免疫荧光染色法鉴定分离的心肌细胞,比较有无血清培养对心肌细胞的影响. 结果: 心肌细胞的存活率为95%以上;存活细胞呈杆状,形态完整,长宽比约为4～6∶ 1;无血清培养心肌细胞只能存活1 wk,形态不发生改变;而加血清培养心肌细胞可存活2 wk以上,但超微结构发生了改变,且不同血清浓度对成纤维细胞生长具有不同的作用. 结论: 主动脉逆行生物酶(胶原酶和蛋白酶)灌流法是比较理想的心肌细胞分离方法;血清对成体心肌细胞的培养起着重要作用.     

人巨噬细胞源性泡沫细胞分化中MaxiK通道α-亚单位的表达

目的研究人单核细胞源性巨噬细胞向泡沫细胞分化过程中MaxiK通道α-亚单位的表达.方法采用密度梯度离心法从男性健康志愿者外周血中分离单核细胞,经培养后分化为巨噬细胞,并通过加氧化型低密度脂蛋白(OxLDL),建立人巨噬细胞源性泡沫细胞模型,采用RT-PCR、蛋白质印迹及免疫细胞化学方法研究MaxiK 通道α-亚单位的表达.结果巨噬细胞同30 mg/L OxLDL孵育60 h后,细胞内总胆固醇(TC),游离胆固醇(FC)及胆固醇酯(CE)显著增加,并且CE/TC从(14.437±6.781)%提高到(57.946±3.507)%.同时,MaxiK通道α-亚单位表达被下调,但同巨噬细胞相比差异无统计学意义(P>0.05).结论人单核细胞源性巨噬细胞同30 mg/L OxLDL孵育60 h后可分化为泡沫细胞,但MaxiK 通道α-亚单位的表达无明显改变.     

阻断Kv1.3和Kir2.1抑制人巨噬细胞源性泡沫细胞分化

目的:研究泡沫细胞分化过程中离子通道Kv1.3和Kir2.1的表达及作用。方法:用30mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)孵育巨噬细胞60h建立泡沫细胞模型。采用免疫细胞化学、RT-PCR和Western印迹检测人单核细胞源性巨噬细胞和泡沫细胞上Kv1.3和Kir2.1的表达。观察Kv1.3和Kir2.1特异性阻断剂rMargatoxin和BaCl2对巨噬细胞胆固醇代谢的影响。结果:ox-LDL(30mg/L)孵育巨噬细胞60h后,细胞内总胆固醇(TC),游离胆固醇(FC)及胆固醇酯(CE)显著增加,CE/TC从(14.4±6.8)%提高到(57.9±3.5)%(P<0.05);但Kv1.3和Kir2.1的表达水平在巨噬细胞组和泡沫细胞组无明显区别(P>0.05)。Kv1.3和Kir2.1分别被rMargatoxin(0.1,10nmol/L)和BaCl2(75,125μmol/L)阻断后,细胞内TC和CE水平显著降低,CE/TC低于50%(P<0.05)。结论:Kv1.3和Kir2.1对泡沫细胞的分化均起关键作用,特异性阻断后能够抑制人单核细胞源性巨噬细胞向泡沫细胞分化。     

培养心肌细胞牵张刺激装置的建立及应用

1　方法　牵张刺激装置的制作如模式图 1.制作实验模型采用材料为有机玻璃板、2 4孔培养板、硅胶膜 (厚度 0 .2 2 μｍ) .硅胶膜从平面圆形变为球形时 ,面积扩大的百分比 =(Ｓ球 -Ｓ园 ) /Ｓ园 ,其中Ｓ球 =ＡＤ2 ,Ｓ园 =ｒ2 ,而ＡＤ2 =ｈ2 +ｒ2 ,其中ｒ为孔的半径 ,ｈ为膜升高的高度图 2 .通过控制ｈ的大小 ,可控制膜被牵拉的强度 .本实验采用使膜面积扩大 2 0 %的强度 ,故ｈ =4ｍｍ[1] .参照Ｋａｓｓｉｒｉ等[2 ,3 ] 方法进行心肌细胞的分离培养 .生长有贴壁心肌细胞的 2 4孔板被固定于牵张装置 ,缓慢充气使硅胶膜向上凸起 4ｍｍ ,分别维持…     

门冬氨酸钾镁片对高血压病患者胰岛素抵抗和动脉弹性的作用

目的:探讨口服镁剂对轻中度高血压病患者的胰岛素抵抗和动脉弹性的作用。方法:112例轻中度高血压病患者,服用安慰剂1周后,随机分为门冬氨酸钾镁组76例和乐卡地平组36例,共服药4周,平行观察两组患者服药前后血压、动脉弹性、糖代谢、胰岛素敏感性及红细胞内Mg2+、Ca2+等指标的变化。结果:门冬氨酸钾镁片组治疗后血压降低、胰岛素敏感性升高、红细胞内Mg2+水平增高,小动脉弹性改善(P均<0.05);乐卡地平组治疗后血压和红细胞内Ca2+降低、大动脉弹性指数增加(P<均0.05);服药后门冬氨酸钾镁组空腹胰岛素水平较乐卡地平组降低,胰岛素敏感性较乐卡地平组增高(P均<0.05),而血压、大动脉弹性指数和小动脉弹性指数、空腹血糖各项指标两组之间无统计学的差异(P均>0.05)。结论:高血压病患者服用门冬氨酸钾镁片可能是通过纠正高血压病患者细胞内低Mg2+的状态,降低血压,改善胰岛素抵抗和小动脉弹性。     

微管蛋白在体外牵张刺激诱导心肌细胞肥大反应中的作用

目的　探讨细胞骨架微管蛋白在牵张刺激心肌细胞肥大反应中的作用。方法　通过体外牵张培养的心肌细胞 ,采用3H 亮氨酸掺入法和四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法反映心肌细胞肥大指标和活心肌细胞数目 ,激光共聚焦定性、定量微管蛋白的合成和分布情况。结果　 2 0 %的持续性牵张引起心肌细胞的3H 亮氨酸掺入量 [12h为 (1870 0± 112 5 )cpm ,2 4h为 (2 0 15 5± 193 7)cpm],与对照组 [12h为 (112 2 7± 12 6 5 )cpm ,2 4h为 (12 10 7± 2 2 2 7)cpm]比较显著增加 ,微管解聚剂秋水仙素 (4μmol L)可以明显抑制3H 亮氨酸掺入量 [12h为 (12 92 7± 14 2 6 )cpm ,2 4h为 (132 7 8± 97 4 )cpm]。牵张 12h即可见微管蛋白荧光强度增强 ,2 4h部分细胞呈现微管蛋白结构坍塌 ,纹理模糊 ,荧光强度分布不均 ,微管蛋白最高光密度值 16 0 0 (任意单位 ) ,可被 4 μmol L秋水仙素抑制。 结论　细胞骨架微管蛋白系统是牵张刺激诱导心肌细胞肥大反应的细胞内信号传递途径之一。     

不同遗传背景及增龄对大鼠高血压胰岛素抵抗相关基因表达谱的影响

目的：探讨不同遗传背景以及增龄对大鼠高血压胰岛素抵抗相关基因表达谱的影响,筛选高血压胰岛素抵抗相关基因.方法：以自发性高血压（SHR）大鼠和Wistar-Kyoto（WKY）大鼠为动物模型,用S4000点基因表达谱芯片分别检测不同遗传背景（14wk SHR大鼠和14wk WKY大鼠）的大鼠肾组织差异表达基因、增龄（SHR大鼠从5wk增龄至14wk）对SHR大鼠肾组织基因表达谱的影响,并从中随机选取2个差异表达基因,用RT-PCR方法进行验证.结果：①SHR大鼠增龄后肾组织中差异表达基因209个;14wk SHR大鼠与14wk WKY大鼠相比较肾组织差异表达基因有166个;②根据SHR大鼠增龄及不同遗传背景大鼠肾组织2种基因表达谱芯片检测结果显示,两者共同差异表达基因11个,其中免疫相关基因2个、代谢相关基因4个、其他类型基因5个.结论：代谢、免疫相关基因表达差异可能在高血压胰岛素抵抗发病中起重要作用.     

阻断MaxiK 通道对人单核细胞源性巨噬细胞向泡沫细胞分化的抑制作用

目的研究高电导钙离子激活钾通道(MaxiK通道)在人单核细胞源性巨噬细胞向泡沫细胞分化的过程中,其mRNA和蛋白的表达及作用。方法采用密度梯度离心加贴壁黏附法,从男性健康志愿者的外周血中分离单核细胞,经5d培养后分化为巨噬细胞。在建立人巨噬细胞源性泡沫细胞模型的基础上,采用免疫细胞化学染色法、RT-PCR及蛋白印迹,研究MaxiK通道α-亚单位的表达,并观察其特异性阻断剂-Paxilline对摄取氧化型低密度脂蛋白(OxLDL)的巨噬细胞中胆固醇代谢的影响。结果将巨噬细胞同30mg/LOxLDL于37℃孵育60h后,细胞体积增大,并有许多红色的脂质颗粒沉积于细胞质内,细胞内的总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)及胆固醇酯(CE)的含量均显著增加,CE/TC从(14.437±6.781)%提高到(57.946±3.507)%(n=7,P<0.05);而MaxiK通道α-亚单位mRNA及蛋白的表达水平没有明显改变(P>0.05)。5和10μmol/L的Paxilline能显著减少巨噬细胞内TC、FC及CE的含量,CE/TC分别降至(41.217±5.584)%和(18.017±11.559)%(n=7,P<0.05),细胞内沉积的红色脂质颗粒也明显减少。结论阻断MaxiK通道能抑制人单核细胞源性巨噬细胞向泡沫细胞分化。     

人巨噬细胞源性泡沫细胞分化中Kir2.1通道的表达

目的 Kir2.1通道是控制骨髓源性巨噬细胞增殖、活化和凋亡的重要离子通道之一,并且还参与细胞分化。本研究观察Kir2.1通道mRNA及蛋白在人单核细胞源性巨噬细胞向泡沫细胞分化过程中的表达。方法 采用密度梯度离心加贴壁黏附法,从男性健康志愿者的外周血中分离单核细胞,经5d培养后分化为巨噬细胞。在建立人巨噬细胞源性泡沫细胞模型的基础上,采用RT-PCR,蛋白质印迹及免疫细胞化学方法研究Kir2.1通道的表达。结果 将巨噬细胞同30mg/L氧化修饰低密度脂蛋白(OxLDL)于37℃孵育60h后,细胞体积增大,并有许多红色的脂质颗粒沉积于细胞质内,细胞内的总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)及胆固醇酯(CE)的含量分别从(54.79±28.304)mg/g、(47.968±26.787)mg/g和(6.822±3.437)mg/g增加至(229.775±57.453)mg/g、(96.241±24.003)mg/g和(133.535±36.292)mg/g,CE/TC从(14.437±6.781)%提高到[(57.946±3.507)%(n=7,P<0.05)]。但是,Kir2.1通道mRNA的扩增量在巨噬细胞和分化的泡沫细胞之间无显著差异[(59.074±10.566)%vs(46.98±12.527)%,n=5,P＞0.05];同样,Kir2.1通道蛋白在巨噬细胞和分化的泡沫细胞之间亦无显著差异[(60.527±18.621)%vs(50.243±11.583)%,n=6,P＞0.05]。结论 人单核细胞源性巨噬细胞同30mg/LOxLDL孵育60h后可分化为泡沫细胞,但Kir2.1通道的表达无明显改变。     

容量超负荷心力衰竭大鼠模型的制备及心脏功能的超声评价

目的：改进容量超负荷大鼠模型制备的方法并探讨超声心动图观察大鼠容量超负荷心力衰竭模型心功能状况的准确性与可靠性。方法采用大鼠腹主动脉下腔静脉造瘘方法建立容量超负荷心力衰竭模型,同时设置对照组,造瘘组40只,对照组20只,应用心脏彩色超声诊断仪动态检测大鼠左室舒张末内径（LVEDD）、左室收缩末内径（LVESD）、左房内径（LAD）及左室射血分数（LVEF）等指标,颈动脉插管测定两组大鼠颈动脉血压（CABP）、左心室收缩末期压力（LVSP）和舒张末期压力（LVDP）,以及反映左心室收缩功能指标的±dp/dtmax值,以评价两组间血流动力学改变;并于术后12周比较两组大鼠心脏质量及心脏重体重比（心体比）。结果造模术后8周,造瘘组大鼠超声心动图表现为左室心腔扩大呈球形,与假手术组比较,射血分数和短轴缩短率明显降低[LVEF：（61.31±3.07）%vs.（77.20±2.41）%;短轴缩短率：（30.37±2.39）%vs.（41.08±2.13）%],左室重量指数增加[（2.85±0.41） vs.（1.59±0.15）],心体比升高[（5.89±0.56） vs.（2.99±0.21）],差异均有统计学意义（P均＜0.01）;造模术后12周,造瘘组大鼠LVDP[（12.53±22.63）mmHg vs.（2.27±1.77）mmHg]和-dp/dtmax[（-3.78±2.14） vs.（-5.80±2.26）]较假手术组升高,LVSP[（108.88±34.39）mmHg vs.（126.48±19.44）mmHg]和＋dp/dtmax[（4.89±2.93） vs.（6.92±1.65）]较假手术组降低（P＜0.05）。结论大鼠超声心动图可较好地动态评价腹主动脉下腔静脉瘘方法建立的容量超负荷心力衰竭模型的心脏形态和心功能状态。