盐酸青藤碱诱导EA.hy926细胞自噬及其在抗炎中的作用

目的探讨中药单体提取物盐酸青藤碱诱导人内皮细胞EA.hy926自噬的机制及其在抗炎中发挥的作用。方法Western blot检测分别以终浓度为50、100μg/mL的盐酸青藤碱处理12h后的EA.hy926细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅱ、ERK2、磷酸化ERK2及炎症细胞因子HMGB1表达变化情况;荧光显微镜观察吖啶橙染色的经盐酸青藤碱诱导后EA.hy926细胞酸性小体变化情况。结果经终浓度为50、100μg/mL的盐酸青藤碱处理EA.hy926细胞后,与对照组比较,100μg/mL的盐酸青藤碱可使自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达(0.67±0.05)及ERK2的磷酸化水平(1.08±0.05)上调(P<0.05),ERK抑制剂U0126可使LC3Ⅱ表达下调(P<0.05)及EA.hy926细胞中酸性小体减少;盐酸青藤碱可抑制EA.hy926中LPS诱导的HMGB1表达,自噬抑制剂氯喹可逆转该细胞中盐酸青藤碱对LPS诱导HMGB1表达的抑制作用(P<0.05)。结论盐酸青藤碱可通过ERK通路诱导EA.hy926细胞自噬,该自噬过程是盐酸青藤碱下调炎症细胞因子HMGB1进而发挥抗炎活性的机制之一。     

血管紧张素Ⅱ升高血管内皮细胞中ROS水平并激活自噬通路

目的: 研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管内皮细胞自噬的影响及其可能机制。方法: 以EA.hy926血管内皮细胞为研究对象,荧光酶标仪检测AngⅡ(10^-7mol/L)、AngⅡ联合N-乙酰半胱氨酸(NAC,50 μmol/L)作用24 h后细胞中活性氧簇(ROS)水平;用不同浓度(10^-8、10^-7、10^-6mol/L)AngⅡ作用24 h或10^-7mol/L AngⅡ作用不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h、36 h)后,通过Western blotting分析微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)蛋白变化、吖啶橙染色结合荧光显微镜观察自噬体形成情况来判断细胞中自噬发生情况;AngⅡ(10^-7mol/L)联合自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,2 mmol/L)或NAC(50 μmol/L)处理24 h后用同样方法检测细胞中自噬的发生情况。结果: 细胞经AngⅡ刺激后细胞内ROS的水平显著升高(P<0.05),LC3-Ⅱ蛋白表达明显增强(P<0.05),自噬体形成明显增加;3-MA或NAC可显著抑制内皮细胞中AngⅡ诱导的LC3-Ⅱ蛋白表达(P<0.05)与自噬体形成。结论: AngⅡ可以通过升高血管内皮细胞内ROS的水平从而诱导自噬的发生。     

二氯乙酸盐增强盐酸吡柔比星杀伤肝癌细胞的研究

目的 探讨二氯乙酸盐(Dichloroacetate,DCA)增强盐酸吡柔比星(Pirarubicin,THP)杀伤肝癌细胞的效果及可能机制.方法 用40 μmol/L DCA与不同浓度(0、200、400、600、800 μmol/L)盐酸吡柔比星(THP)联合处理肝癌HepG2细胞24 h,采用CCK-8法检测对细胞增殖的影响.然后用40 μmol/L二氯乙酸盐与600 μmol/L盐酸吡柔比星联合处理肝癌HepG2细胞24 h,用Western blot检测细胞中PARP的表达变化及JNK的磷酸化水平;用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS的水平.结果 DCA可显著增强不同浓度THP对肝癌HepG2细胞的杀伤效果,与PBS组相比具有统计学差异(P＜0.05);DCA联合THP处理24 h可显著升高细胞内的ROS水平,与PBS联合THP组相比具有统计学差异(P＜0.05);此外,DCA联合THP可使HepG2细胞中凋亡相关分子PARP的剪切明显增加,并增强JNK的磷酸化水平.抗氧化剂NAC可显著降低DCA与THP联合处理对HepG2细胞中JNK的激活作用.结论 DCA可显著增强THP杀伤肝癌细胞效应,其机制可能与ROS/JNK通路的激活有关.     

左旋棉酚通过ERK通路诱导Daudi细胞发生自噬及意义

目的 探讨左旋棉酚诱导淋巴瘤Daudi细胞发生自噬可能机制及对细胞存活率的影响.方法 采用CCK-8法检测左旋棉酚在体外对Daudi细胞增殖抑制作用的影响;采用台盼蓝排斥实验检测不同处理对细胞存活率的影响;Western blot检测细胞中自噬相关蛋白LC3、ERK和磷酸化ERK的表达情况;AO染色观察经左旋棉酚处理后Daudi细胞酸性小体的变化情况.结果 左旋棉酚能剂量依赖性地抑制Daudi细胞的增殖和促进细胞死亡;AO染色后经左旋棉酚处理的细胞内可观察到大量的酸性小体形成;Western blot显示左旋棉酚能显著上调自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达及增强磷酸化ERK的水平,抑制ERK的磷酸化能下调LC3Ⅱ的表达;ERK抑制剂U0126及自噬抑制剂CQ和3-MA均能显著增强左旋棉酚的杀细胞效力.结论 左旋棉酚可能通过ERK通路诱导Daudi细胞发生自噬,抑制ERK介导的自噬能够显著增强左旋棉酚的抗瘤效应.     

左旋棉酚通过细胞自噬下调Namalwa细胞中B淋巴细胞刺激因子的表达

目的探讨左旋棉酚[(-)-gossypol]下调Namalwa细胞中B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)的可能机制。方法采用CCK8、台盼蓝活细胞染色检测左旋棉酚在体外对Namalwa细胞的生长抑制作用,吖啶橙(acridine orange,AO)染色观察经左旋棉酚处理后细胞自噬的形态特征,Western blot检测细胞中BLyS和自噬蛋白微管蛋白轻链3(LC3)的表达情况。结果左旋棉酚对Namalwa细胞有明显的增殖抑制作用,并且具有时间和剂量依赖性;AO染色后细胞内可观察到明显的细胞自噬小体;Western blot结果显示,左旋棉酚可下调Namalwa细胞中BLyS的表达,并上调LC3Ⅱ蛋白的表达;自噬特异性抑制剂3-methyladenine(3-MA)可显著抑制左旋棉酚对BLyS的下调与LC3Ⅱ的上调作用。结论左旋棉酚可能通过诱导细胞自噬来下调B淋巴细胞中BLyS的表达,从而抑制细胞生长。