姜黄素对体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞的生物学作用

目的：观察姜黄素体外抗增生性瘢痕的作用．方法：以增生性瘢痕成纤维细胞为靶细胞,分别用不同浓度的姜黄素培养液培养,MTT法测定细胞的增殖情况,透射电镜进行形态学检测,流式细胞仪技术结合PI及Annexin V双标记染色检测姜黄素的促凋亡作用,实时荧光定量聚合酶链反应检测Ⅰ,Ⅲ型前胶原及Bcl-2 mRNA的表达情况．结果：姜黄素对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖有抑制作用;透射电镜观察发现,处理组凋亡细胞增多,凋亡细胞表现出典型的超微结构特征;流式细胞仪检测发现,随着药物浓度的增加,增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡率也在逐渐升高;实时荧光定量聚合酶链反应检测结果显示,姜黄素处理后Ⅰ、Ⅲ型前胶原及Bcl-2 mRNA的表达水平均下调．结论：姜黄素具有一定的体外抗增生性瘢痕的作用．     

热损伤角质形成细胞培养上清液对成纤维细胞生物学行为的影响

目的 了解KC热损伤后培养上清液对真皮Fb生物学行为的影响.方法 分离培养人真皮Fb,另建立KC(选用HaCaT细胞)热损伤模型.收集正常堵养及热损伤后12 h的KC培养上清液,用无血清DMEM以1:1体积比稀释,分别制成正常KC和热损伤KC 2种条件培养液.将Fb分别用无血清DMEM和2种条件培养液培养:(1)于培养12、24、36、48 h时,采用噻唑蓝法检测Fb增殖活性;(2)于培养12 h时,用流式细胞术检测Fb的凋亡情况(Fb预先致热损伤,并增设Fb伤后无处理对照);(3)培养24 h时,用免疫荧光法检测Fb胞质α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况,并用实时定量PCR法测定Fb α-SMA mRNA的表达.对实验结果进行单因素方差分析,用LSD-t检验行组间两两比较.结果 (1)Fb增殖活性:Fb经热损伤KC条件培养液培养12、24、36、48 h时,其吸光度值均高于同时相点用无血清DMEM培养的Fb(t值分别为1.89、2.35、2.02、1.94,P值均小于0.01);其中12、24、48 h时与用正常KC条件培养液培养的Fb比较,差异有统计学意义(12 h时t=1.83,P<0.01;24 h时t=2.91,P<0.05;48 h时t=1.83,P<0.05).(2)Fb凋亡检测:热损伤KC条件培养液培养的Fb与正常KC条件培养液培养以及伤后无处理的Fb比较,凋亡率均明显下降(t=3.31,P<0.05;t=1.47,P<0.01).(3)Fb胞质α-SMA表达:荧光显微镜下可见,用无血清DMEM或正常KC条件培养液培养的Fb中,α-SMA阳性表达(红色荧光)细胞较少;热损伤KC条件培养液培养的Fb中,α-SMA阳性表达细胞明显增多.(4)α-SMA mRNA表达:热损伤KC条件培养液培养的Fb α-SMA mRNA相对表达量为1.32±0.06,高于正常KC条件培养液培养的Fb(1.14±0.07,t=2.51,P<0.05)和无血清DMEM培养的Fb(1.00±0.09,t=1.77,P<0.05).结论 KC热损伤后12 h培养上清液可明显促进Fb增殖、抑制Fb凋亡、促进Fb向肌成纤维细胞转分化.     

姜黄素对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的影响

背景：近期研究提示姜黄素可能是一种抗纤维化制剂。 目的：以瘢痕疙瘩成纤维细胞为靶细胞，观察不同浓度姜黄素对瘢痕疙瘩成纤维细胞合成胶原的影响。 设计、时间及地点：随机对照实验，于2006-10/2007-11在解放军第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科完成。 材料：瘢痕疙瘩患者的手术标本5份，患者均知情同意。治疗方案经医院医学伦理委员会批准。姜黄素为美国Sigma公司产品。 方法：瘢痕疙瘩成纤维细胞体外原代培养，待细胞融合后传代，取第3~6代对数生长期的成纤维细胞用于实验。将不同浓度姜黄素(5，10，20 μmol/L)分别对瘢痕疙瘩成纤维细胞干预24~48 h，以空白组做对照。 主要观察指标：蛋白免疫印迹检测姜黄素作用瘢痕疙瘩成纤维细胞后结缔组织生长因子的表达。荧光定量聚合酶链反应检测姜黄素作用瘢痕疙瘩成纤维细胞后Ⅰ、Ⅲ型前胶原及结缔组织生长因子基因的表达。 结果：①姜黄素作用瘢痕疙瘩成纤维细胞 48 h后，结缔组织生长因子蛋白的表达减少，均低于对照组（P < 0.01）。②与对照组相比，不同浓度姜黄素干预组Ⅰ、Ⅲ型前胶原及结缔组织生长因子表达均降低（P < 0.01），并且Ⅰ型前胶原表达随着药物浓度的增加，有逐渐降低的趋势，成明显的量效关系。姜黄素20 μmol/L组Ⅲ型前胶原表达低于姜黄素10 μmol/L组，但差异无显著性意义（P > 0.05），姜黄素10 μmol/L组结缔组织生长因子表达低于姜黄素5 μmol/L组，但差异无显著性意义（P > 0.05）。 结论：姜黄素对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成有明显抑制作用，其作用机制可能与姜黄素抑制结缔组织生长因子在瘢痕疙瘩成纤维细胞的表达有关。     

压力面罩联合支具对烧伤后面部瘢痕的效果比较

目的 比较压力面罩联合面中部硬性支具与压力面罩和3D压力面具对烧伤后面部瘢痕的康复效果。方法 选取2017年9月至2019年6月空军军医大学第一附属医院烧伤与皮肤外科收治的面部深Ⅱ°烧伤后瘢痕患者38例,根据患者意愿分别采用压力面罩(压力面罩组,n = 15)、压力面罩联合面中部硬性支具(联合组,n = 17)或3D压力面具(3D组,n = 6)进行治疗。分别于治疗前和治疗后1年,应用温哥华瘢痕量表(VSS)进行评定,问卷调查患者佩戴舒适度,并计算各组治疗总费用。结果 联合组1例不能耐受。各组治疗后VSS评分下降(F = 18.49, P < 0.05),压力面罩组治疗后VSS评分比联合组高1.717分(95%CI 0.925~2.482, P < 0.001),比3D组高1.782分(95%CI 0.738~2.827, P < 0.001),联合组与3D组无显著性差异(0.065分,95%CI -0.957~1.088, P = 1.000)。3组患者舒适度分别为60%、52.9%和66.7%,无显著性差异(P > 0.05)。3D组治疗费用最高(12000~16000元),压力面罩组(3000~4800元)与联合组(3300~5300元)费用相似。结论 压力面罩联合面中部硬性支具的治疗效果接近3D压力面具,费用更便宜,是经济或技术条件受限地区患者面部烧伤后瘢痕康复的合适选择。     

人体病理性瘢痕组织中过氧化物酶体增殖物激活受体的表达

研究显示,过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)除了促进脂肪形成和胰岛素稳态外,还参与许多细胞功能的调控,如拮抗转化生长冈子β1(TGF-β1)的促纤维化效应[1-3].作为一种拮抗组织纤维化的内源性保护因子,PPAR在一些器官纤维化(如糖尿病性肾小球硬化症)中旱弱表达[4-5].在皮肤的病理性瘢痕组织巾,PPAR、结缔组织生长因子(CTGF)和TGF-β1是否也有表达差异,是本研究的关注重点.     

严重烧伤大鼠血清对脂肪间质干细胞生物学特性的影响

目的 探讨严重烧伤大鼠血清对体外培养的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)生物学特性的影响.方法 取雄性SD大鼠双侧腹股沟脂肪组织,采用胶原酶消化法、分离纯化大鼠ADSCs,取第3代细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面标志物,行成脂成骨诱导分化鉴定;ADSCs传代后按随机数字表法分为10％胎牛血清组(正常培养组)、10％正常大鼠血清组,10％烧伤大鼠血清组,采用噻唑蓝(MTT)法测定各组细胞的生长曲线.通过流式细胞仪检测各组细胞的生长周期、Real-time PCR法检测各组细胞血管内皮生长因子(VEGF)、凋亡相关因子Caspase-3的表达情况.结果 分离培养的ADSCs传至第3代时形态规则,经流式细胞仪检测,所培养的ADSCs均表达CD29、CD90、CD105,阳性率分别为88.6％、99.7％、92.8％,而CD31、CD34、CD45阳性率分别为4.4％、4.7％、3.3％;经诱导培养后可向成骨成脂分化.MTT法检测结果显示:10％烧伤大鼠血清组细胞增殖较快,各时间点吸光度值(A值)明显高于10％胎牛血清组及10％正常大鼠血清组.流式细胞仪检测结果显示:培养1周后10％烧伤大鼠血清组、10％正常大鼠血清组、10％胎牛血清组ADSCs G1期细胞比例分别为:(72.20±5.13)％、(83.50±4.74)％、(90.20±6.37)％;S期细胞比例分别为:(21.40±2.84)％、(12.50±1.96)％和(8.60±1.31)％,10％烧伤大鼠血清组ADSCs G1期细胞比例显著低于10％正常大鼠血清组、10％胎牛血清组(t=2.39、4.86;P ＜0.05);10％烧伤大鼠血清组ADSCs S期细胞比例显著高于10％正常大鼠血清组、10％胎牛血清组(=5.54,7.93;P＜0.01).Real-Time PCR检测结果显示:10％烧伤大鼠血清组VEGF的表达明显上调,Caspase-3表达显著下调与10％正常大鼠血清组、10％胎牛血清组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 10％烧伤大鼠血清可明显促进ADSCs的增殖、抑制细胞凋亡发生、促进ADSCs的分泌功能,严重烧伤后可望移植ADSCs用?     

Smad交互蛋白1在增生性瘢痕组织中的表达及其对纤维化相关因子的影响

目的研究Smad交互蛋白1（SIP1）在人增生性瘢痕组织中的表达及其对纤维化相关因子的影响。方法收集临床整形手术切取的9例患者增生性瘢痕标本及其自体正常皮肤标本。分离培养原代人增生性瘢痕成纤维细胞（HSFBs）,取第3-5代细胞用于实验。（1）免疫组织化学法检测增生性瘢痕组织标本及其自体正常皮肤组织标本中SIP1的表达情况。（2）真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/SIP1转染HSFBs。按照随机数字表法将细胞分为6组：对照组;pcDNA3.1（＋）组（空载体组）;pcDNA3.1（＋）/SIP1组;对照＋TGF-β1组;pcDNA3.1（＋）＋TGF-β1组;pcDNA3.1（＋）/SIP1＋TGF-β1组。于转染后第48 h和72 h分别提取细胞总RNA和细胞总蛋白。应用实时荧光定量PCR法检测各组细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及结缔组织生长因子（CTGF）的mRNA表达水平;采用Western-blotting检测α-SMA的蛋白表达水平。结果 （1）免疫组织化学染色结果显示：增生性瘢痕组织中SIP1表达明显低于自体正常皮肤组织。（2）pcDNA3.1（＋）/SIP1转染HSFBs后纤维化相关因子的表达：①α-SMA的mRNA和蛋白表达水平：与对照组和pcDNA3.1（＋）组相比,pcDNA3.1（＋）/SIP1组在mRNA和蛋白表达水平均显著下调,差异有统计学意义（P〈0.05）。当细胞给予TGF-β1刺激后,各组α-SMA表达均上调,但pcDNA3.1（＋）/SIP1＋TGF-β1组mRNA和蛋白表达水仍低于对照＋TGF-β1组,差异有统计学意义（P〈0.05）。②CTGF的mRNA表达水平：与对照组和pcDNA3.1（＋）组相比,pcDNA3.1（＋）/SIP1组在mRNA表达水平显著下调,差异有统计学意义（P〈0.05）。当细胞给予TGF-β1刺激后,各组CTGF表达均显著上调,但pcDNA3.1（＋）/SIP1＋TGF-β1组mRNA表达水仍低于对照＋TGF-β1组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论与正常皮肤组织相比较,SIP1在增生性瘢痕组织中低表达。SIP1基因转染HSFBs可降低纤维化相关因?     

激活Hacat细胞表面Toll样受体促进创面愈合的机制

目的：细胞表面Toll样受体对激发先天性免疫、抵抗微生物感染有重要作用。最近研究发现激活细胞表面Toll样受体不仅可以预防微生物感染，还可以促进组织再生。实验通过脂多糖激活体外培养的角质细胞株Hacat细胞表面Toll样受体，观察其促进创面愈合的可能机制。 方法：实验于2007-07在解放军第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科完成。①实验分组及方法：角质细胞株Hacat由解放军第四军医大学西京医院皮肤科馈赠；脂多糖为Sigma公司产品；小鼠抗入Toll样受体2单克隆抗体、兔抗人Toll样受体4多克隆抗体购于ebioscience公司。体外培养Hacat细胞，根据脂多糖（500ng/L）与Hacat细胞共培养24，48，72h将细胞随机分为脂多糖作用24h组、脂多糖作用48h组、脂多糖作用72h组，另设对照组，只加溶剂二甲基亚枫。②实验评估：蛋自免疫印迹技术检测脂多糖对Hacat细胞Toll样受体2、Toll样受体4及核因子KB表达的影响：荧光定量聚合酶链反应检测脂多糖作用后Hacat细胞内基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子的表达。 结果：光学显微镜下正常入皮肤表皮及角质细胞Toll样受体2、Toll样受体4表达呈蓝黑色：脂多糖作用于Hacat细胞24，48，72h后Toll样受体2、Toll样受体4、核因子-κB表达均高于对照组（P〈0．01）。与对照组相比，其他3组基质金属蛋白酶3及血管内皮生长因子表达均增高（P〈0．01，P〈0．05）。脂多糖作用24h组基质金属蛋白酶9表达与对照组差异无显著性（P〉0．05），脂多糖作用48，72h组与对照组比较，差异显著（P〈0．05）。 结论：激活Hacat细胞表面Toll样受体有促进创面愈合作用，其机制可能与脂多糖作用了：Toll样受体从而激活核因子KB信号传导通路促进细胞释放基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子等因素有关?     

胰岛素干预后脂肪干细胞旁分泌对人血管内皮细胞的作用

目的 了解胰岛素刺激后脂肪干细胞(ADSC)旁分泌因子的变化及其对人血管内皮细胞的作用.方法 (1)分离培养人ADSC,按照随机数字表法将细胞分为胰岛素刺激组(含终浓度1×10-7mol/L胰岛素的无血清DMEM培养液培养)和对照组(未加胰岛素的无血清DMEM培养液培养),每组6孔.3 d后收集ADSC培养上清液(ADSC-CM),ELISA法测定血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)表达量.(2)分离培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),将细胞按照随机数字表法分为4组,均采用内皮细胞专用培养液培养:胰岛素刺激ADSC-CM组,培养液中加入经胰岛素刺激后的ADSC-CM;无刺激ADSC-CM组,培养液中含无胰岛素刺激的ADSC-CM;胰岛素组,培养液中加入终浓度为1×10-7mol/L的胰岛素;空白对照组,培养液中不添加刺激因素.3 d后噻唑蓝法测定HUVEC增殖情况,数据用吸光度值表示.(3)另取HUVEC同上分为4组,培养12 h时,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素双染色法测定细胞凋亡情况.(4)另取HUVEC同上分为4组后,体外细胞划痕法测定划痕后12、24、36、48 h时HUVEC迁移距离.对实验数据行t检验.结果 (1)胰岛素刺激组VEGF、HGF含量分别为(643±64)、(930±68)pg/mL,显著高于对照组的(287±47)、(577±84)pg/mL(t值分别为18.869、18.475,P值均小于0.05).(2)胰岛素刺激ADSC-CM组、无刺激ADSC-CM组吸光度值分别为0.847±0.042、0.798±0.022,均高于胰岛素组的0.665±0.028(t值分别为4.579、3.732,P值均小于0.01)及空白对照组的0.674±0.031(t值分别为3.761、4.073,P值均小于0.01);胰岛素刺激ADSC-CM组吸光度值较无刺激ADSC-CM组明显增高(t=2.576,P＜0.05).(3)胰岛素刺激ADSC-CM组、无刺激ADSC-CM组细胞凋亡率分别为(5.8±1.9)%、(9.0±2.0)%,均明显低于胰岛素组的(30.4±6.0)%(t值分别为12.891、10.417,P值均小于0.05)和空白对照组的(31.4±7.4)%(t值分别为11.474、9.783,P值均小于0.05);无刺激ADSC-CM组细胞凋亡率高于胰岛素刺激ADSC-CM组(t=8.548,P＜0.05).(4)划痕后36、48 h时,胰岛素刺激ADSC-CM组、无刺激ADSC-CM组HUVEC迁移距离明显长于胰岛素组与空白对照组,且胰岛素刺激ADSC-CM组细胞迁移距离大于无刺激ADSC-CM组(t值分别为4.076、4.573,P值均小于0.05).结论 胰岛素干预后ADSC旁分泌能更有效促进人血管内皮细胞增殖、迁移并抑制其凋亡,有利于组织血管化.

Abstract：

Objective To study the biological effects of the paracrine from ADSC after being stimulated by insulin on vascular endothelial cells. Methods(1) ADSC was isolated from human adipose tissue and cultured in vitro. The third generation cells were collected and divided into insulin group (1, cultured with serum-free DMEM containing 1 × 10-7 mol/L insulin) and control group (C, cultured with serum-free DMEM) according to the random number table, with 6 slots in each group. Three days later, ADSC culture medium (ADSC-CM) was collected for determination of levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) and hepatocyte growth fator (HGF) by ELISA. (2) Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were cultured to the third generation, and they were cultured with special nutrient solution and divided into ADSC-CM with insulin stimulation group (AI) , ADSC-CM without insulin stimulation group (AC), insulin group(I, with same concentration as above), blank control group (BC) according to the random number table. Three days later, proliferation of HUVEC was determined with MTT method(with expression of absorbance value). Another two samples of HUVEC were respectively divided into 4 groups as above for determination of apoptosis rate with Annexin V/FITC double-staining 12 hours after culture, and H UVEC migration with scratch adhesion test at post scratch hour (PSH) 12, 24, 36, 48. Data were processed with t test.Results(1) Compared with those in C group [(287 ± 47) , (577 ± 84) pg/mL, respectively] , the secretion levels of VEGF and HGF in I group [(643 ±64) , (930 ±68) pg/mL, respectively] were significantly increased(with t value respectively 18. 869, 18. 475, P values all below 0.05). (2) The absorbance value of HUVEC in AI and AC groups was 0. 847 ± 0. 042, 0. 798 ± 0.022, respectively, which were higher than that in I and BC groups [0. 665 ± 0. 028(with t value respectively 4. 579, 3. 732) , 0. 674 ± 0.031(with t value respectively 3. 761, 4. 073) , P values all below 0. 01] , and that in AI group was higher than that in AC group(t =2.576, P ＜0.05). The apoptosis rates of HUVEC in AI and AC groups [(5.8±1.9)%,(9.0 ± 2.0)%, respectively] were obviously lower as compared with that in I and BC groups [(30.4 ±6. 0) %(with t value respectively 12. 891, 10.417),(31.4 ± 7.4) %(with t value respectively 11. 474,9. 783), P values all below 0. 05], and that in AC group was higher than that in AI group(t = 8. 548, P ＜0. 05). The distance of migration of HUVEC in AI and AC groups were greater than that in I and BC groups at PSH 36, 48, and that in AI group was greater as compared with that in AC group(with t value respectively 4.076, 4. 573, P values all below 0. 05). Conclusions Paracrine from ADSC after being stimulated by insulin can promote proliferation and migration of HUVEC, and suppress its apoptosis, and it is beneficial for tissue vascularization.