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目的构建耐RNase酶的内含禽流感病毒H5N1亚型部分核酸序列的病毒样颗粒。方法构建中间载体pET32a-MS2,将禽流感病毒H5N1亚型的HA、NA和M基因片断连接到中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA和pET32a-MS2-M,分别转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒。结果表达载体经PCR、酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。电镜观察到了病毒样颗粒,荧光定量RT-PCR试验表明颗粒稳定性良好。结论成功构建了含禽流感病毒H5N1部分核酸序列的病毒样颗粒且稳定性良好,可作为禽流感H5N1亚型RNA检测的标准品和质控品。 相似文献
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目的 建立利用液相芯片技术检测甲、乙型流感和H5N1亚型高致病性禽流感病毒的方法,并对该方法进行评价。方法 对GenBank中甲型流感病毒的NP、乙型流感病毒的HA以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因片段序列进行同源性比对,根据保守序列,设计针对各基因的简并引物和寡核苷酸探针,制备探针偶联微球,将样本核酸多重PCR扩增产物与微球进行杂交,以Bio-Plex液相芯片检测系统进行芯片检测。结果 该方法可以对甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒(H5N1)的H5、N1基因同时进行检测,病毒核酸的最低检出量为1pg,检测特异性高。结论 成功构建了甲、乙型流感病毒和H5N1亚型高致病性禽流感病毒液相芯片检测系统,为流感、禽流感的快速检测、诊断奠定了基础。 相似文献
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目的 研究肠道病毒71型(EV71)感染神经细胞的miRNA表达谱,探讨miRNA在病毒感染神经细胞中的可能作用.方法 建立EV71感染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)模型,收集感染后48 h细胞.以Taqman低密度芯片检测miRNA表达谱,使用实时RT-PCR对芯片结果进行验证并在TargetScan和miRanda网站预测靶基因,采用GO和KEGG分析靶基因功能.结果 成功建立EV71感染SH-SY5Y细胞模型,通过低密度芯片筛选出215种显著升高的miRNA和25种显著下调的miRNA.经过RT-PCR验证,3种miRNA(MiR-10a*、miR-15b*和miR-195)显著下调,7种miRNA(miR-10a、miR-342-5p、miR-483-5p、Let-7b、miR-99a、miR-140-5p和miR-21)显著上调,与芯片结果相符.GO分析显示发展进程和信号调节条目最富集靶基因.KEGG路径分析显示靶基因在肿瘤路径、蛋白水解、Wnt信号传导、黑素形成、粘附连接、MAPK信号通道最富集.结论 EV71感染神经细胞48 h后miRNA表达谱发生改变,10种变化的miRNA靶基因预测在发展进程、信号传导及凋亡中起着重要的作用,可为后期机制研究提供参考. 相似文献
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目的:构建人源性去整合素金属蛋白酶9(ADAM9)基因真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞).方法:利用包含ADAM9全长编码核酸序列的质粒PCR4-TOPO作为模板,用PCR扩增其核心编码区,将其克隆至PMD18-T Vector中构建PMD18-T-ADAM9质粒,同时双酶切PMD18-T-ADAM9及P... 相似文献
5.
[目的]构建耐RNase酶的内含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒。[方法]构建中间载体pET32a-MS2,将甲型H1N1流感病毒的HA基因片段连接中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒,对病毒样颗粒进行荧光定量RT-PCR检测和稳定性实验。[结果]表达载体经PCR、酶切鉴定分析后证实构建成功,荧光定量RT-PCR实验表明该病毒颗粒含有HA基因片段并且颗粒稳定性良好。[结论]成功构建了含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒且稳定性良好,有望作为甲型H1N1流感病毒RNA检测的标准品和质控品。 相似文献
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目的 构建含有肠道病毒(EV)5'端非编码区(5'-UTR)部分RNA序列的耐核糖核酸酶(RNase)病毒样颗粒.方法 利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-MS2.将肠道病毒5'-UTR基因片段连接到中间载体的下游,构建原核表达载体pET32a-MS2-EV.将其转化宿主菌,IPTG诱导表达,并进行RT-PCR检测和稳定性实验.结果 表达载体pET32a-MS2-EV经PCR、双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功.RT-PCR和稳定性实验结果 表明,诱导产生的病毒样颗粒内含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列,并且稳定性良好.结论 成功构建了含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列的病毒样颗粒,可作为肠道病毒检测时的标准品和质控品使用. 相似文献
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目的:了解甲型H1N1(2009)流感流行后的流感样病例(ILI)中,除流感病毒外的相关病原分布,为ILI患者临床治疗、流行病学调查提供参考。方法:收集流感监测哨点医院393份ILI咽拭子标本提取核酸,应用实时荧光PCR方法进行20种相关病原比对检测,分析各病原的阳性率与构成比。结果:检测出阳性咽拭子标本51例,分属13种共计64株病原体,其中阳性率较高的为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、冠状病毒。另有13例为两种病原体混合感染,占阳性标本数的25.49%。结论:ILI的病原构成比较复杂,且存在混合感染,临床治疗与流行病学调查均应引起重视。 相似文献
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目的:建立检测手足口病病原的液相芯片方法。方法:设计、合成并修饰基因特异性引物和寡核苷酸探针,将寡核苷酸探针和荧光编码微球进行偶联,制备液相芯片;将样本核酸多重PCR扩增产物与液相芯片进行杂交,并通过液相芯片检测仪读取检测结果。结果:同时检测多种肠道病毒(EV),肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CAV16)的病毒核酸最低检出量均为1pg,检测特异性高。与参照方法相比,EV、EV71、CAV16的检测灵敏度分别为:91.4%、92.9%、100.O%,检测特异度分别为100.0%、97.1%、98.2%,检测准确度分别为:100.0%、96.3%、87.5%。结论:构建的检测手足口病病原的液相芯片方法,具有高通量、灵敏度高、特异性强和检测时间短等优点,为手足口病的快速诊断奠定了基础。 相似文献
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目的建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法。方法针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件。用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法。进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较。结果以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应。RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918)。结论建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测。 相似文献
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