Tet-on和Cre／loxP双调控肝靶向表达Cre重组酶转基因小鼠的制备和功能评价

目的制备Tet-on和Cre/loxP系统双重调控下肝靶向性表达Cre重组酶的转基因小鼠rtTALAP-1/LC-1并评价其功能,为最终建立可突破胚胎期免疫耐受的双调控型HCV转基因小鼠模型奠定基础。方法选取适龄rtTALAP-1转基因小鼠与LC-1转基因小鼠交配,PCR法检测子代rtTALAP-1/LC-1转基因小鼠基因组中是否插入了rtTA元件和Cre基因片段。双阳性rtTALAP-1/LC-1小鼠dox诱导1周后,以小动物活体成像系统检测小鼠肝脏的Luc萤光素酶信号,免疫组化检测Cre重组酶在小鼠肝脏等组织中的表达状况。结果 rtTALAP-1/LC-1转基因小鼠在dox诱导后,仅在其肝脏检测到清晰的Luc萤光素酶信号,而其他脏器均未检测到萤光信号;免疫组化法也仅在小鼠肝细胞核中检测到Cre重组酶的表达,心脏、肾脏和骨骼肌等其他组织均未检测到Cre重组酶的表达。结论成功制备了rtTALAP-1/LC-1转基因小鼠,其靶基因表达的诱导反应性和肝靶向性均良好,为最终制备双调控型丙型肝炎病毒（HCV）转基因小鼠模型奠定了良好的基础。     

调控型表达丙型肝炎病毒NS3／4A蛋白酶转基因小鼠的建立

目的建立调控因素存在下表达丙型肝炎病毒（HCV）NS3/4A丝氨酸蛋白酶的转基因小鼠。方法采用分子克隆技术构建可受Tet-On调控系统和Cre-LoxP基因敲除系统双重调控表达HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶的真核表达质粒PBI-Ⅲ/LoxP-Luc-PolyA-LoxP-NS3/4A。该重组质粒线性化后,经显微注射制备转基因小鼠。首建鼠及经PCR检测阳性的子代鼠与C57BL/6小鼠交配传代。选择部分F2鼠与已经稳定建系的转基因小鼠Lap杂交,利用在体生物发光成像系统（BLI）检测肝脏稳定表达荧光素酶（Luc）报告基因的经盐酸强力霉素（Dox）诱导的双转基因子代鼠,并选择性针对稳定表达系传代扩群。结果酶切鉴定和测序分析显示重组载体构建成功。经PCR检测得到6只转基因首建鼠,其中3只可繁殖传代并持续检测到阳性子代鼠。BLI结果显示,由其中1只首建鼠传代而来的不同F2鼠与Lap鼠杂交得到的部分双转基因鼠肝脏部位发光信号强烈,表明这些小鼠肝细胞内报告基因Luc特异高效表达。结论建立了转基因小鼠NS3/4A,并筛选到调控因素存在时转入外源基因特异稳定表达的转基因小鼠,为进一步建立严格调控型表达NS3/4A蛋白酶的小鼠模型奠定基础。     

氯丙嗪穴位注射治疗顽固性呃逆9例疗效观察

1998年1月，我们应用足三里穴位注射盐酸氯丙嗪治疗顽固性呃逆9例，效果满意，现报道如下。     

乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）截短C基因和前S1基因重组原核表达质粒,获得融合蛋白的表达并进行抗原性分析．方法：PCR扩增获得截短C基因片段和前S1基因,双酶切后克隆至原核表达质粒pET28a,转化E．coli DH5α,酶切鉴定得阳性重组质粒pET28a并测序;然后转化E．coli B121,IPTG诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达蛋白组成;可溶性分析后用Ni^2＋ -NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白,Westem Blot分析特异性和抗原性．结果：成功构建了HBV截短C基因和前S1基因融合的原核表达质粒pET28a—Ct—preS1,目的基因可高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,Ni^2＋ -NTA纯化可获得目的蛋白,纯化蛋白具有良好的抗原性和特异性．结论：HBV截短HBcAg和preS1抗原融合蛋白可高效表达并得到纯化,为研究新型乙肝疫苗奠定了基础．     

HBV截短core基因融合preS1基因在BCG中的表达及其免疫应答

目的:探讨HBV相关抗原在卡介苗(BCG)中的有效表达及其刺激产生的体液和细胞免疫应答效果。方法:将带有HBV截短C基因和preS1基因片段的穿梭载体转化BCG菌株,筛选重组菌,SDS-PAGE和Western blot实验分析其抗原表达特性;分别以生理盐水、BCG、BCG-pDE22、BCG-pDE22-CS1皮下注射BALB/c小鼠,进行连续抗体测定和细胞毒性T细胞杀伤实验。结果:与对照组相比,重组BCG可表达Mr为24000的新生蛋白,与CS1融合蛋白大小相符,Westernblot实验分析显示出良好的抗原结合特性;带有HBVCS1抗原基因的重组BCG免疫组抗体滴度显著升高,特异性杀伤能力更强。结论:BCG可以作为HBV相关抗原的活载体,为研制HBV新型疫苗提供了实验依据。     

人源性抗丙型肝炎病毒核糖体展示单链抗体库的构建

核糖体展示抗体库技术是制备人源性单链抗体的良好技术平台,该技术将表型与基因型相联系,可以从构建的抗体库中筛选到高亲和力的抗体,同时可找到编码此抗体的基因.本实验从丙型肝炎病毒(HCV)阳性患者的外周血淋巴细胞中扩增VH和VL基因,通过重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)构建了大容量的人源性核糖体展示scFv,文库,为获得特异的人源性抗HCv scFv奠定了基础.     

丙型肝炎病毒核心区截短型基因真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的：建立截短的丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的真核表达载体，并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中瞬时表达：方法：应用多聚酶链反应（PCR），以HCV-H株全长cDNA序列为模板，扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段，克隆人真核表达载体pcDNA3．1（-），并通过脂质体转染至CHO细胞。结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1-Ct，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3．1-Ct在CHO细胞中表达截短型的C蛋白。结论：成功构建羧基端部分缺失的HCVC区基因的真核表达载体，瞬时转染CHO细胞，为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗（BCG）活载体疫苗奠定基础。     

HCV NS3蛋白单克隆抗体的制备及其识别区域的分析

目的 制备针对丙型肝炎病毒（HCV）非结构区NS3全长蛋白的单克隆抗体（MAb），并分析获得的单抗识别表位所在区域，为建立以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究提供抗体工具。方法 用原核表达的HCV非结构区NS3全长蛋白作为免疫原，采用小鼠腹股沟皮下NC膜包埋法免疫小鼠，按常规杂交瘤细胞的制备方法，经细胞融合、克隆化制备抗NS3蛋白的MAb。用间接免疫荧光法和Westem blot鉴定其特异性。分别构建NS3丝氨酸蛋白酶（NS3蛋白的N末端1／3）编码基因的真核表达质粒pcDNA3．1（-）-ns3p、NS3解旋酶（NS3蛋白的C末端2/3）编码基因的真核表达质粒pcDNA3．1（-）-ns3A，将其瞬时转染COS-7细胞后，以获得的单克隆抗体作为一抗，通过免疫荧光分析获得单抗识别表位所在的区域。结果 获得了2株抗NS3蛋白的单克隆抗体，这2株MAbs均特异识别NS3蛋白，并确定了它们的结合区域。结论 获得了针对NS3蛋白的单克隆抗体，并对其单抗识别表位所在的区域进行了分析，为下一步进行以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究奠定了良好的基础。     

HCV复合多表位抗原基因的克隆表达及其免疫学特性分析

目的构建丙型肝病炎病毒（HCV）截短C基因和多表位基因重组原核表达质粒，表达纯化融合蛋白，分析其免疫原性和抗原性。方法PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct；合成HCVE2区模拟表位与NS3～NS57个表位基因Em；分别将Ct、Em克隆人原核表达质粒pQE30，筛选阳性重组质粒pQE30-CtEm，转化E．coli M15，IPTG诱导融合蛋白表达，薄层扫描分析表达蛋白；可溶性分析后用Ni^2＋-NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白；Westernblot分析纯化蛋白的特异性和抗原性；纯蛋白免疫小鼠后分析其免疫原性。结果成功构建了HCV复合多表位抗原基因的原核表达质粒pQE30-CtEm，目的基因可高效表达，表达产物主要以包涵体形式存在，Ni^2＋-NTA纯化可获得目的蛋白，纯化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。结论HCV复合多表位抗原基因融合蛋白可高效表达并得到纯化，该融合蛋白可作为HCV诊断抗原，也为丙型肝炎新型疫苗的研究提供了靶抗原。     

丙型肝炎病毒CTL表位基因真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的构建含丙型肝炎病毒（HCV）复合多表位基因的真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染细胞系。方法通过生物信息学预测分析的方法得到涵盖HCV不同基因型与小鼠H2复合体的多个细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位,串联后人工合成基因序列,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,然后利用脂质体法转染CHO细胞,通过持续G418筛选建立稳定转染细胞株。最后通过荧光显微镜观察、RT-PCR和Western Blot等方法证实多表位基因的表达。结果所构建的含有HCV复合多表位基因的真核表达载体pEGFP-mEpi在CHO细胞中能稳定表达。结论真核表达载体的成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究复合多表位疫苗的基因免疫奠定了基础。