江苏省南通地区丙型肝炎病毒的分子流行病学分析

目的 :调查南通地区丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的亚型分布特征。方法 :2012年5—9月间,在南通市第三人民医院收集到109例全血样本用以病毒的RNA提取,RT-PCR扩增和测序。所得的病毒序列与HCV参考序列构建系统发育树。结果:在收集到的109例HCV抗体(Anti-HCV Ig G)阳性样本中,有49例HCV RNA阳性,基于NS5B和C/E2片段构建的进化树显示,南通地区至少流行有1b、2a、3a、3b、6a 5个亚型病毒株。其中,1b是最主要流行的病毒株,占阳性样本中的63.3%;2a次之,占20.4%;3a、3b、6a 3个亚型分别占4.1%、8.2%和4.1%。相较于在普通人群中1b(68.9%)和2a(22.2%)为主要流行的病毒株,6a(50.0%)是静脉吸毒人群中最流行的亚型。结论:多个亚型的HCV病毒株共流行于南通地区,其中1b和2a是最主要流行的病毒株。     

乙型肝炎病毒B、C基因型全基因组序列的克隆

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)B、C基因型全基因组序列克隆。方法从HBV无症状慢性携带者中筛选B、C基因型,提取病毒核酸,设计引物,应用高保真酶对3 200bp的HBV DNA进行全序列扩增,通过克隆技术构建pGEM-HBV重组质粒,测序后进行序列分析。结果获得HBV B基因型和HBV C基因型重组质粒各1株。结论成功构建HBV B基因型和HBV C基因型的全基因组序列克隆,可为进一步研究HBV分子流行病学和基础研究提供工具。     

乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药株基因组分析

目的：分析乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)阿德福韦酯耐药株的基因序列。方法：从已发生阿德福韦酯临床耐药的慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,设计保守引物,采用高保真聚合酶对耐药株HBV DNA进行全序列扩增,通过克隆技术构建PGEM-HBV重组质粒,测序后进行序列分析。结果：获得阿德福韦酯耐药的HBV DNA全长序列克隆,序列长度为3261 bp,序列分析发现在逆转录区有rtA181V位点突变。结论：阿德福韦酯耐药株HBV DNA全长序列克隆的成功构建,为阿德福韦酯临床耐药性研究提供参考。     

多疣壁虎SPARCL1多克隆抗血清的制备及鉴定

目的：制备针对多疣壁虎SPARCL1的多克隆抗体,为深入研究SPARCL1基因功能奠定基础。方法：构建pGEX-4T1-SPARCL1质粒,在大肠杆菌BL21表达GST-SPARCL1蛋白,经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔,获得SPARCL1抗血清,经酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测SPARCL1抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体特异性。结果：成功构建多疣壁虎SPARCL1基因的原核表达质粒pGEX-4T1-SPARCL1,诱导得到较高纯度的GST-SPARCL1融合蛋白,免疫兔获得SPARCL1抗血清,经Western-blot及免疫组织化学实验显示所得抗体具有较高的效价及特异性。结论：成功获得较高效价特异性强的SPARCL1抗血清,为进一步深入研究多疣壁虎SPARCL1功能提供抗体工具。     

溶血标本对乙型肝炎病毒表面抗原检测结果的影响

乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的检测是诊断乙型肝炎的主要指标。随着检验技术的不断发展，酶联免疫吸附试验（ELISA）一步法检测HBsAg的试剂、方法也已成熟，因其方法简便、灵敏度高、特异性强、实验条件要求不高，而被各级各类医疗机构广泛采用。虽然检测时标本要求空腹采集，不能溶血，但往往在实际工作中会因种种原因造成标本溶血。     

流式细胞术检测产IFN-γ的T淋巴细胞及在肺结核诊断中的应用*

目的：建立流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测产IFN-γ CD4+ T淋巴细胞的方法，探讨该方法对肺结核辅助诊断的应用价值。方法：收集42例肺结核患者及30例正常体检者肝素钠抗凝血，分离外周血单个核细胞，经结核杆菌特异性ESAT-6和CFP-10混合抗原刺激后，以流式细胞术检测经荧光抗体染色的产IFN-γ的CD4+ T淋巴细胞比率，以受试者工作曲线评价该方法对肺结核的诊断效能并与T-SPOT.TB法进行比较。结果：FCM法肺结核组产生IFN-γ CD4+T淋巴细胞数比率为（3.96±2.32）%，显著高于对照组的（0.62±0.26）%，差异有统计学意义（P<0.001）。FCM法受试者工作曲线下面积为0.9821，以阳性细胞比率0.93%为临界值，其诊断肺结核的灵敏度为95.24%，特异性为93.33%，与T-SPOT.TB法相近。结论：流式细胞术检测产IFN-γ CD4+ T淋巴细胞的方法对肺结核具有一定的辅助诊断价值。     

新型冠状病毒肺炎患者T淋巴细胞亚群分析

目的：分析新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎）患者T淋巴细胞亚群的变化及临床意义。方法：检测新冠肺炎患者外周血白细胞计数及分类,并与正常对照组比较;采用流式细胞仪检测新冠肺炎患者急性期及恢复期外周血T淋巴细胞亚群。结果：与对照组比较,新冠肺炎患者中性粒细胞百分数增加,淋巴细胞百分数和淋巴细胞绝对数下降,差异均有统计学意义（P＜0.05）;急性期58.33%新冠肺炎患者CD3+细胞绝对数下降,54.17%患者CD4+细胞绝对数下降,45.83%患者CD8+细胞绝对数下降,恢复期患者CD3+、CD4+、CD8+细胞绝对数高于急性期,差异均有统计学意义（P＜0.05）。恢复期CD3+、CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值与急性期比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论：测定新型冠状病毒肺炎患者T淋巴细胞亚群的变化对患者的治疗与预后有重要的临床参考价值。     

利用重叠延伸PCR快速构建中国株乙型肝炎病毒的感染性克隆

目的：体外扩增中国株乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的基因组全长序列,快速构建中国株HBV感染性克隆,建立中国株HBV体外复制细胞模型。方法：设计保守引物,扩增HBV全长基因组序列。对扩增到的HBV基因组进行DNA测序及计算机辅助分析,确定病毒的基因型。通过重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）技术,构建1.3倍基因组长度的HBV感染性克隆质粒pHBV1.3。将pHBV1.3质粒转染人肝癌细胞系HepG2,采用Western Blot、酶联免疫吸附试验及Real-PCR检测病毒复制及表达情况。检测该感染性克隆对临床抗病毒药物阿德福韦的敏感性。结果：成功扩增到1株C基因型HBV全长基因组,其GenBank登陆号为KF495606。构建了中国株HBV感染性克隆pHBV1.3（C）质粒,该质粒能在肝癌细胞株中进行有效的复制、转录和表达。阿德福韦能在体外抑制该HBV感染性克隆的复制,抑制程度依赖于药物浓度。结论：利用SOE-PCR可快速构建HBV感染性克隆,所构建的感染性克隆能介导高水平病毒复制,可用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究。     

小RNA SbfR增强伤寒沙门菌动力和侵袭力

目的: 探究小RNA SbfR对伤寒沙门菌动力和侵袭力的影响及其潜在机制。方法: 用前期构建的SbfR缺陷株（△SbfR+pBAD/Myc HisA）、SbfR回补株（△SbfR＋pBAD/Myc HisA SbfR）和空载体株（WT+pBAD/Myc HisA）进行细菌动力实验和HeLa细胞侵袭实验,观察SbfR对伤寒沙门菌的动力和对HeLa细胞侵袭力的影响。通过基因芯片分析SbfR缺陷株与回补株全基因组表达的差异,并进一步用qRT PCR分析SbfR对2个鞭毛和2个侵袭相关基因的调控作用。结果： 与空载体株、SbfR回补株比较,SbfR缺陷株动力和侵袭力均明显下降（P＜0.01或0.05）;缺陷株鞭毛和侵袭相关基因的转录表达水平均比回补株明显下降（均P＜0.05）。 结论： SbfR通过促进鞭毛和侵袭相关基因的表达,增强伤寒沙门菌的动力和侵袭力。